miRNA expression analyses en cancer de la prostate tissus cliniques
Summary
Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).
Abstract
Un défi essentiel à cancer de la prostate (CaP) prise en charge clinique est posé par l'insuffisance des biomarqueurs actuellement utilisés pour le dépistage de la maladie, le diagnostic, le pronostic et le traitement. Au cours des dernières années, les microARN (miARN) ont émergé biomarqueurs suppléants prometteuses pour le diagnostic du cancer de la prostate et le pronostic. Cependant, le développement de biomarqueurs miARN comme efficaces pour cancer de la prostate repose en grande partie sur leur détection précise dans les tissus cliniques. miARN analyse des spécimens cliniques sur le cancer de la prostate est souvent difficile en raison de l'hétérogénéité tumorale, les erreurs d'échantillonnage, la contamination du stroma, etc. Le but de cet article est de décrire un flux de travail simplifié pour miARN analyse en FFPE archivé ou spécimens cliniques sur le cancer de la prostate frais congelé en utilisant une combinaison de quantitative PCR en temps réel (RT-PCR) et l'hybridation in situ (ISH). Dans ce flux de travail, nous optimisons les méthodologies existantes pour l'extraction de miARN FFPE et tissu de la prostate gelées et l'expression analyses par TaqMan sonde basée miARN RT-PCR. En outre, nous décrivons une méthode optimisée pour ISH analyse de la détection formiRNA dans les tissus de la prostate à l'aide de l'acide nucléique verrouillé (LNA) – sondes basées. Notre protocole optimisé ISH miARN peut être appliquée sur les lames de cancer de la prostate ou de tissus microarrays de tissu de cancer de prostate (TMA).
Introduction
Cancer de la glande de la prostate est une tumeur maligne mâle fréquemment diagnostiqué qui est l'une des principales causes de mortalité liée au cancer chez les hommes. Aux États-Unis, on estime que 220,800 nouveaux cas et 27,540 décès seront rapportés en 2015 1.
Cancer de la prostate est une maladie hétérogène avec une maladie très variable Cours-tumeurs peuvent être indolent ou très agressif. Un défi majeur dans le cancer de prostate gestion clinique est posé par l'insuffisance des méthodes actuellement utilisées / biomarqueurs pour le dépistage de la maladie, le diagnostic, le pronostic et le traitement 2. Méthodes de dépistage actuelles comprennent l'antigène (PSA) des tests spécifiques de la prostate et un toucher rectal (DRE), suivi par biopsies de la prostate 3. Antigène spécifique de la prostate (PSA) est le biomarqueur du cancer de la prostate le plus largement utilisé qui a considérablement révolutionné la gestion clinique et l'amélioration des taux de survie 4. Toutefois, en raison des limites inhérentes de PSA incluant le lack de spécificité, le dépistage à base de PSA-dessus a conduit à un diagnostic et un traitement sur de la maladie. Dans cette perspective, des efforts intensifs sont dirigés vers la recherche de biomarqueurs du cancer de la prostate de rechange, en particulier ceux qui peuvent prédire l'agressivité de la maladie et de conduire de meilleures décisions de traitement 4,5. Au cours des quelques dernières années, les microARN (miARN) sont apparus comme des biomarqueurs du cancer de la prostate alternatives prometteuses.
Les microARN (miARN) constituent une classe évolutif conservé de petits ARN non-codants qui suppriment l'expression génique post-transcriptionnelle par des interactions spécifiques de séquence avec les régions non traduites 3 'UTR () de cibles d'ARNm apparentés. On estime que> 60% des ARNm cibles sont conservées de miARN 6. miRNA gènes sont situés dans les régions intergéniques ou dans des introns ou exons de protéines / non-protéique gènes codant 7. Ces gènes sont préférentiellement transcrites par l'ARN polymérase II dans primamiARN ry (pri-miARN, plusieurs kilobases de long) qui forment en épingle à cheveux en forme de tige-boucle structures secondaires. Ces pri-miARN sont transformées en précurseurs miARN (pré-miARN, 60-75 nucléotides de long) qui sont exportés vers le cytoplasme et traitées ultérieurement dans miARN matures (18-25 nucléotides de long) 8-10. miARN régulent les processus cellulaires clés, y compris la prolifération, le développement, la différenciation et l'apoptose 11. Des études suggèrent une dérégulation généralisée des profils d'expression de miARN dans diverses affections malignes humaines, notamment le cancer de la prostate de 12 à 15. les profils d'expression de miARN ont été rapportés pour être largement dérégulée dans le cancer de la prostate primaire et métastatique. L'expression du miARN modifié ont été liés à la progression du cancer de la prostate, de l'agressivité et de la récurrence soulignant le potentiel pronostique des miARN 12,14,16-19. Un nombre croissant de preuves indique que miARN jouent des rôles importants dans l'initiation mécanistes de cancer de la prostate, le développement, le progrèsion et les métastases. Globalement, miARN sont en train de biomarqueurs suppléants prometteuses pour le diagnostic du cancer de la prostate et le pronostic qui peuvent distinguer entre les tissus normaux et cancéreux et de l'aide dans la stratification des tumeurs de la prostate 12. Aussi, miARN sont des cibles importantes pour le développement de traitements efficaces contre le cancer de la prostate 20.
En raison de leur petite taille et de résistance à l'activité de RNase endogène, miARN sont biomarqueurs stables qui peuvent être facilement détectés dans les tissus fixés au formol et 21 biopsies de la prostate 22. En outre, les profils d'expression des miARN ont été comparés dans les tissus fixés au formol et congelés et ont été trouvés à être fortement corrélé 21. Toutefois, l'expression des miARN profilage dans les tissus cliniques sur le cancer de la prostate est souvent difficile en raison de l'hétérogénéité tumorale, les erreurs d'échantillonnage, la contamination du stroma etc. Le développement des miARN comme biomarqueurs efficaces pour cancer de la prostate fortement relies sur leur détection précise dans les tissus cliniques. Nous décrivons ici un workflow simplifié utilisé dans notre laboratoire pour l'expression des miARN profilage dans FFPE archivé ou échantillons cliniques de cancer de la prostate frais congelé. Nous employons une combinaison de PCR quantitative en temps réel et l'hybridation in situ pour les miARN dans les analyses d'échantillons cliniques, avec l'ancien donnant davantage d'informations quantitatives et celui-ci pour visualiser l'expression différentielle des biomarqueurs miARN potentiels dans un éventail de tissus. Dans ce flux de travail, nous optimisons les méthodologies existantes pour l'extraction miARN de FFPE et les tissus de la prostate congelés, les analyses d'expression par TaqMan sonde basée miARN RT-PCR et miARN technique d'hybridation in situ en utilisant l'acide nucléique verrouillé (LNA) à base de sondes 23. Sondes à base de LNA offrent une sensibilité et une spécificité accrue par rapport à l'ADN ou de l'ARN sondes basées et permet une détection robuste de toutes les séquences de miARN, quelle que soit leur teneur en GC et permettent également discrimination des familles de miARN. Notre protocole optimisé ISH miARN peut être appliquée sur les lames de cancer de la prostate ou de tissus microarrays de tissu de cancer de prostate (TMA), ce dernier offrant la possibilité d'accélérer la découverte de biomarqueurs miARN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous décrivons un flux de travail simplifié pour l'expression du miARN profilage dans FFPE archivé ou tissus cliniques sur le cancer de la prostate frais congelé. Dans le cancer de la prostate, plusieurs études suggèrent un rôle important des microARN dans cancer de la prostate initiation, la progression et les métastases. Cependant, des résultats contradictoires sont souvent obtenus sur un miRNA spécifique 22 depuis l'extraction des miARN et analyses méthodes diffèrent l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Roger Erickson pour son soutien et aide à la préparation du manuscrit.
Ce travail a été soutenu par le National Cancer Institute à la National Institutes of Health
(Grant Nombre RO1CA177984; RO1CA138642), le projet de programme de VA sur cancer de la prostate (BX001604).
Materials
| Microtome | Leica Biosystems | RM2255 | |
| Arcturus Autopix for LCM | Arcturus/ Life Technologies | LCM1621/LCM1110 | Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| miRNeasy FFPE Kit | Qiagen | 217504 | |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4351106 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR master mix | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4352042 | |
| DIG labeled LNA probe for U6 | Exiqon | 99002-01 | |
| BM Purple AP substrate | Roche | 11442074001 | |
| Pre-hybridization solution | Biochain | K2191050-1 | |
| Hybridization solution | Biochain | K2191050-2 | |
| Blocking solution | Biochain | K2191050-8 | |
| AP-conjugated anti-digoxigenin antibody | Biochain | K2191050-7 | |
| Aqueous mounting media | Vector Laboratories | H-5501 | |
| Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent) | Life Technologies | 15596-018 | |
| Harris hematoxylin | Statlab | SL200 | |
| Eosin | Statlab | SL201 |
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