miRNA Expression Analyser i Prostate Cancer Clinical Vev
Summary
Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).
Abstract
En kritisk utfordring i prostatakreft (PCA) klinisk ledelse utgjøres av utilstrekkelighet i dag brukes biomarkører for sykdom screening, diagnose, prognose og behandling. I de senere årene, microRNAs (mirnas) har dukket opp som lovende alternative biomarkører for prostatakreft diagnose og prognose. Imidlertid har utviklingen av mirnas som effektive biomarkører for prostatakreft sterkt avhengig av deres nøyaktig deteksjon i kliniske vev. miRNA analyser i prostatakreft kliniske prøver er ofte utfordrende på grunn av svulst heterogenitet, utvalgsfeil, stromal forurensning etc. Målet med denne artikkelen er å beskrive en forenklet arbeidsflyt for miRNA analyser i arkivert FFPE eller fersk frosset prostatakreft kliniske prøver ved hjelp av en kombinasjon av kvantitativ real-time PCR (RT-PCR) og in situ hybridisering (ISH). Innenfor denne arbeidsflyten, optimalisere vi de eksisterende metoder for miRNA utvinning fra FFPE og frosset prostata tissues og uttrykk analyser av Taqman-probe basert miRNA RT-PCR. I tillegg beskriver vi en optimalisert metode for ISH analyser formiRNA deteksjon i prostata vev ved hjelp låst nukleinsyre (LNA) – basert sonder. Vår optimalisert miRNA ISH-protokollen kan brukes på prostata kreft vev lysbilder eller prostatakreft microarray (TMA).
Introduction
Kreft i prostata er en vanlig diagnostisert mannlig malignitet som er en av de viktigste årsakene til kreft relatert dødelighet blant menn. I USA, anslagsvis 220,800 nye tilfeller og 27,540 dødsfall vil bli rapportert i 2015 en.
Prostatakreft er en heterogen sykdom med svært variabel sykdom kurset svulster kan være lat eller veldig aggressiv. En kritisk utfordring i prostatakreft klinisk ledelse utgjøres av utilstrekkelighet i dag brukes metoder / biomarkører for sykdom screening, diagnose, prognose og behandling 2. Nåværende screening metoder inkluderer prostataspesifikt antigen (PSA) testing og en digital endetarms eksamen (DRE) etterfulgt av prostatabiopsier 3. Prostataspesifikt antigen (PSA) er den mest brukte prostatakreft biomarkør som har betydelig revolusjon klinisk ledelse og bedret overlevelse 4. Men på grunn av iboende begrensninger av PSA inkludert lack av spesifisitet, PSA-basert screening har ført til over diagnose og behandling i løpet av sykdommen. I lys av dette, er intensiv innsats er rettet mot å lete etter alternative prostatakreft biomarkører, spesielt de som kan forutsi aggressiviteten av sykdommen og drive bedre behandling beslutninger 4,5. I løpet av de siste årene, microRNAs (mirnas) har dukket opp som lovende alternative prostatakreft biomarkører.
MicroRNAs (mirnas) utgjør et evolusjonært konservert klasse av små ikke-kodende RNA som undertrykke genekspresjon post-transcriptionally via sekvensspesifikke interaksjoner med 3'- utranslaterte regioner (UTR) av beslektede mRNA mål. Det er anslått at> 60% av mRNA er konservert mål for mirnas 6. miRNA gener er lokalisert i intergeniske regioner eller innen introner eller exoner av protein / non-protein kodende gener 7. Disse genene er fortrinnsvis transkribert av RNA polymerase II i primary mirnas (pri-mirnas, flere kilobaser lang) som danner hårnål formet stammen løkke sekundære strukturer. Disse pri-mirnas blir behandlet i forløper mirnas (pre-mirnas, 60-75 nucleotide lang) som eksporteres til cytoplasma og videre bearbeidet til modne mirnas (18-25 nucleotide lange) 8-10. mirnas regulere viktige cellulære prosesser, inkludert spredning, utvikling, differensiering og apoptose 11. Studier tyder på en utbredt feilregulering av miRNA uttrykk profiler i ulike menneskelige maligniteter inkludert prostatakreft 12-15. miRNA uttrykk profiler har blitt rapportert å være mye dysregulerte i grunnskolen og metastatisk prostatakreft. Altered miRNA uttrykket har blitt koblet med prostatakreft progresjon, aggressivitet og tilbakefall fremhever den prognostiske potensialet miRNAs 12,14,16-19. En voksende mengde bevis indikerer at mirnas spiller viktige mekanistiske roller i prostatakreft initiering, utvikling, fremdriftion og metastasering. Samlet sett mirnas er fremstår som lovende alternative biomarkører for prostatakreft diagnose og prognose som kan skille mellom normale og kreft vev og hjelp i lagdeling av prostatakreft 12. Også mirnas er viktige mål for utvikling av effektive behandlingsformer mot prostatakreft 20.
På grunn av sin lille størrelse og motstand mot endogen RNase aktivitet, mirnas er stabile biomarkører som kan lett oppdages i formalinfiksert vev 21 og i prostatabiopsier 22. Dessuten har ekspresjonsprofiler av mirnas er sammenlignet i frosne og formalinfikserte vev og har blitt funnet å være sterkt korrelert 21. Imidlertid er miRNA uttrykket profilering i prostatakreft kliniske vev ofte utfordrende på grunn av svulst heterogenitet, utvalgsfeil, stromal forurensning etc. Utviklingen av mirnas som effektive biomarkører for prostatakreft tungt relies på deres nøyaktig deteksjon i kliniske vev. Her beskriver vi en forenklet arbeidsflyt brukes i vår lab for miRNA uttrykket profilering i arkivert FFPE eller fersk frosset prostatakreft kliniske prøver. Vi benytter en kombinasjon av kvantitativ real-time PCR og in situ hybridisering for miRNA analyser av kliniske prøver, med det tidligere, hvilket ga mer kvantitativ informasjon, og den sistnevnte for å visualisere den differensielle ekspresjonen av potensielle biomarkører miRNA i en rekke vev. Innenfor denne arbeidsflyten, optimalisere vi de eksisterende metoder for miRNA utvinning fra FFPE og frosne prostata vev, analyser uttrykk av Taqman-probe basert miRNA RT-PCR og miRNA in situ hybridisering teknikk med låst nukleinsyre (LNA) -baserte sonder 23. LNA-baserte prober gir økt sensitivitet og spesifisitet i forhold til DNA- eller RNA- prober basert robust og muliggjør påvisning av alle miRNA sekvenser, uavhengig av deres GC-innhold og også tillate diskrimineringsjon av miRNA familier. Vår optimalisert miRNA ISH-protokollen kan brukes på prostata kreft vev lysbilder eller prostatakreft microarray (TMA), med sistnevnte som tilbyr muligheten til å akselerere miRNA biomarkører.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen beskriver vi en forenklet arbeidsflyt for miRNA uttrykket profilering i arkivert FFPE eller fersk frosset prostatakreft kliniske vev. I prostatakreft, flere studier antyder en viktig rolle microRNAs i prostatakreft initiering, progresjon og metastasering. Imidlertid er motstridende resultater ofte oppnås på en bestemt miRNA 22 siden miRNA utvinning og analyserer metoder variere mye. I lys av den nye bevis som støtter den potensielle anvendelsen av mirnas som alternative prostata kreft bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Roger Erickson for hans støtte og bistand med utarbeidelse av manuskriptet.
Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute ved National Institutes of Health
(Grant Antall RO1CA177984; RO1CA138642), VA program prosjektet på prostatakreft (BX001604).
Materials
| Microtome | Leica Biosystems | RM2255 | |
| Arcturus Autopix for LCM | Arcturus/ Life Technologies | LCM1621/LCM1110 | Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| miRNeasy FFPE Kit | Qiagen | 217504 | |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4351106 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR master mix | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4352042 | |
| DIG labeled LNA probe for U6 | Exiqon | 99002-01 | |
| BM Purple AP substrate | Roche | 11442074001 | |
| Pre-hybridization solution | Biochain | K2191050-1 | |
| Hybridization solution | Biochain | K2191050-2 | |
| Blocking solution | Biochain | K2191050-8 | |
| AP-conjugated anti-digoxigenin antibody | Biochain | K2191050-7 | |
| Aqueous mounting media | Vector Laboratories | H-5501 | |
| Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent) | Life Technologies | 15596-018 | |
| Harris hematoxylin | Statlab | SL200 | |
| Eosin | Statlab | SL201 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
- Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
- Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
- Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what’s new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
- Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
- Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
- Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
- Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
- Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
- Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
- Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
- Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
- Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
- Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
- Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
- Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
- Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2′-Amino- and 2′-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
- Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
- Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
- Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
- Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).
