As análises de expressão de miRNA no câncer de próstata tecidos clínicos
Summary
Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).
Abstract
Um desafio crucial no cancro da próstata (PCA) manejo clínico é representada pela inadequação dos biomarcadores atualmente utilizados para o rastreio da doença, diagnóstico, prognóstico e tratamento. Nos últimos anos, microARNs (miARNs) surgiram como biomarcadores alternativos promissores para o diagnóstico e prognóstico do cancro da próstata. No entanto, o desenvolvimento de miARNs como biomarcadores eficazes para o cancro da próstata depende fortemente de sua detecção precisa em tecidos clínicos. analisa miRNA em amostras clínicas de câncer de próstata é muitas vezes um desafio devido à heterogeneidade do tumor, erros de amostragem, a contaminação do estroma etc. O objetivo deste artigo é descrever um fluxo de trabalho simplificado para análises de miRNA em FFPE arquivado ou espécimes clínicos de câncer de próstata fresco congelado usando uma combinação de -PCR quantitativo em tempo real (RT-PCR) e hibridação in situ (ISH). Dentro desse fluxo de trabalho, otimizar as metodologias existentes para a extração de miRNA de FFPE e congelado tissu próstataes e expressão análises por sonda Taqman-base miRNA RT-PCR. Além disso, nós descrevemos um método otimizado para ISH analisa detecção formiRNA em tecidos da próstata, utilizando ácido nucleico bloqueado (LNA) – sondas de base. Nosso protocolo miARN ISH optimizada pode ser aplicada a lâminas de tecido de cancro da próstata ou cancro da próstata Tissue microarrays (TMA).
Introduction
O câncer de próstata é um tumor maligno masculino comumente diagnosticado que é uma das principais causas de mortalidade relacionada com câncer entre os homens. Nos EUA, uma 220,800 novos casos estimados e 27.540 mortes serão relatados em 2015 1.
O câncer de próstata é uma doença heterogênea com doença altamente variável course- tumores podem ser indolente ou muito agressivo. Um desafio crítico no manejo clínico do câncer de próstata é representada pela inadequação dos atualmente utilizados métodos / biomarcadores para o rastreio da doença, diagnóstico, prognóstico e tratamento 2. Métodos de rastreio atuais incluem antígeno (PSA), em específico da próstata e um exame de toque retal (DRE), seguido de biópsias de próstata 3. Antígeno específico da próstata (PSA) é o biomarcador de câncer de próstata mais amplamente utilizado que revolucionou significativamente a gestão clínica e melhoria das taxas de sobrevivência 4. No entanto, devido às limitações inerentes de PSA incluindo lack de especificidade, o rastreio baseada em PSA levou a mais de diagnóstico e tratamento ao longo da doença. Em vista disso, os esforços intensivos estão sendo direcionados para a busca de biomarcadores de câncer de próstata alternativos, especialmente aqueles que podem prever a agressividade da doença e tomar melhores decisões de tratamento 4,5. Ao longo dos últimos anos, microRNAs (miRNAs) surgiram como promissoras biomarcadores de câncer de próstata suplentes.
Os microRNAs (miRNAs) constituem uma classe evolutivamente conservadas de pequenos RNAs não-codificantes que suprimem a expressão gênica pós-transcricionalmente através de interacções específicas para a sequência com os 3'- não traduzidas (UTRs regiões) de alvos de RNAm cognatos. Estima-se que> 60% de mRNAs são alvos de miARNs 6 conservada. miRNA genes estão localizados em regiões intergénicas ou dentro de exões intrões ou de proteína / proteína não-codificantes genes 7. Estes genes são preferencialmente transcrito pela ARN-polimerase II em primamiRNAs ry (pri-miRNAs, vários quilobases de comprimento) que as estruturas secundárias de loop haste em forma de forma hairpin. Estes miRNAs pri-são transformados em miRNAs precursoras (pré-miRNAs, 60-75 nucleótidos de comprimento) que são exportados para o citoplasma e novamente transformadas em miRNAs maduros (18-25 nucleótidos de comprimento) 8-10. miARNs regular processos celulares chave, incluindo a proliferação, desenvolvimento, diferenciação e apoptose 11. Estudos sugerem uma desregulação generalizada de perfis de expressão de miARN em várias malignidades humanas, incluindo cancro da próstata 12-15. perfis de expressão de miARN têm sido relatados para ser amplamente desregulado no cancro da próstata primário e metastático. MiRNA expressão alterada têm sido relacionados com a progressão do câncer de próstata, agressividade e recorrência destacando o potencial prognóstico de miRNAs 12,14,16-19. Um crescente corpo de evidências indicam que os miRNAs desempenham papéis importantes mecanicistas na iniciação do câncer de próstata, o desenvolvimento, o progressoião e metástase. No geral, os miRNAs estão emergindo como biomarcadores alternativas promissoras para o diagnóstico e prognóstico do câncer de próstata que podem distinguir entre tecidos e ajuda normais e cancerosas na estratificação de tumores de próstata 12. Além disso, os miRNAs são alvos importantes para o desenvolvimento de terapias eficazes contra o câncer de próstata 20.
Devido ao seu pequeno tamanho e resistência à actividade da RNase endógena, miARNs biomarcadores são estáveis que podem ser facilmente detectadas em tecidos fixados em formalina 21 e 22 em biópsias da próstata. Além disso, os perfis de expressão miARNs foram comparadas em tecidos congelados e fixados em formalina e foram encontrados para ser fortemente correlacionada 21. No entanto, a expressão miRNA perfis em tecidos clínicos de câncer de próstata é muitas vezes um desafio devido à heterogeneidade do tumor, erros de amostragem, a contaminação do estroma etc. O desenvolvimento de miRNAs como biomarcadores eficazes para o cancro da próstata fortemente reliES na sua detecção precisa em tecidos clínicos. Aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho simplificado utilizado em nosso laboratório para a expressão miRNA de perfis FFPE arquivado ou espécimes clínicos de câncer de próstata fresco congelado. Nós empregar uma combinação de PCR quantitativo em tempo real e a hibridização in situ para miARN análises de amostras clínicas, com a ex-rendendo mais informações quantitativas e o último para visualizar a expressão diferencial de biomarcadores potenciais miARN em uma variedade de tecidos. Dentro desse fluxo de trabalho, otimizar as metodologias existentes para a extração de miRNA de FFPE e tecidos da próstata congelados, analisa expressão por Taqman-sonda baseada miRNA RT-PCR e miRNA in situ utilizando técnica de hibridização de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) à base de sondas 23. Sondas à base de LNA oferecem maior sensibilidade e especificidade em relação ao ADN ou RNA-sondas base e permite a detecção robusta de todas as seqüências de miRNA, independentemente do seu conteúdo GC e também permitir que discriminação de famílias de miARN. Nosso protocolo miARN ISH optimizada pode ser aplicada a lâminas de tecido de cancro da próstata ou cancro da próstata Tissue microarrays (TMA), com este último que oferece o potencial para acelerar miARN descoberta biomarcador.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, descrevemos um fluxo de trabalho simplificado para criação de perfil de expressão de miRNA em FFPE arquivados ou tecidos clínicos de câncer de próstata fresco congelado. No cancro da próstata, diversos estudos sugerem um papel importante na iniciação da microARNs cancro da próstata, progressão e metástase. No entanto, resultados conflitantes são frequentemente obtidos em um determinado miRNA 22 desde a extração de miRNA e analisa métodos diferem amplamente. Em vista da evidência…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Roger Erickson por seu apoio e assistência na preparação do manuscrito.
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional do Câncer, no Instituto Nacional de Saúde
(Grant Número RO1CA177984; RO1CA138642), projeto de programa VA sobre o câncer de próstata (BX001604).
Materials
| Microtome | Leica Biosystems | RM2255 | |
| Arcturus Autopix for LCM | Arcturus/ Life Technologies | LCM1621/LCM1110 | Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| miRNeasy FFPE Kit | Qiagen | 217504 | |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4351106 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR master mix | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4352042 | |
| DIG labeled LNA probe for U6 | Exiqon | 99002-01 | |
| BM Purple AP substrate | Roche | 11442074001 | |
| Pre-hybridization solution | Biochain | K2191050-1 | |
| Hybridization solution | Biochain | K2191050-2 | |
| Blocking solution | Biochain | K2191050-8 | |
| AP-conjugated anti-digoxigenin antibody | Biochain | K2191050-7 | |
| Aqueous mounting media | Vector Laboratories | H-5501 | |
| Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent) | Life Technologies | 15596-018 | |
| Harris hematoxylin | Statlab | SL200 | |
| Eosin | Statlab | SL201 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
- Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
- Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
- Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what’s new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
- Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
- Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
- Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
- Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
- Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
- Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
- Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
- Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
- Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
- Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
- Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
- Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
- Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2′-Amino- and 2′-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
- Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
- Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
- Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
- Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).
