Los análisis de expresión de miRNA en tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata
Summary
Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).
Abstract
Un reto fundamental en el cáncer de próstata (CaP) manejo clínico se plantea por la insuficiencia de los biomarcadores que actualmente se utilizan para la detección de la enfermedad, diagnóstico, pronóstico y tratamiento. En los últimos años, microRNAs (miRNAs) han surgido como biomarcadores alternativas prometedoras para el diagnóstico y el pronóstico del cáncer de próstata. Sin embargo, el desarrollo de miRNAs como biomarcadores eficaces para el cáncer de próstata depende en gran medida su detección precisa en tejidos clínicos. miARN análisis en muestras clínicas de cáncer de próstata a menudo es un reto debido a la heterogeneidad del tumor, los errores de muestreo, la contaminación del estroma etc. El objetivo de este artículo es describir un flujo de trabajo simplificado para miARN analiza en FFPE archivado o especímenes clínicos sobre el cáncer de próstata fresco congelado usando una combinación de cuantitativa en tiempo real PCR (RT-PCR) e hibridación in situ (ISH). Dentro de este flujo de trabajo, optimizamos las metodologías existentes para la extracción de miRNA de FFPE y tissu próstata congeladoES y la expresión por análisis Taqman-sonda basada miARN RT-PCR. Además, se describe un método optimizado para ISH análisis de detección formiRNA en los tejidos de la próstata utilizando ácido nucleico cerrado (LNA) – sondas basadas. Nuestro protocolo miRNA ISH optimizado se puede aplicar a las diapositivas de cáncer de próstata de tejido o microarrays de tejidos de cáncer de próstata (TMA).
Introduction
El cáncer de próstata es un tumor maligno masculina comúnmente diagnosticado que es una de las principales causas de la mortalidad relacionada con el cáncer entre los hombres. En Estados Unidos, se estima que 220.800 nuevos casos y 27.540 muertes se reportaron en 2015 1.
El cáncer de próstata es una enfermedad heterogénea con enfermedad muy variable supuesto- tumores pueden ser indolente o muy agresivo. Un reto fundamental en el manejo clínico del cáncer de próstata es el que plantea la insuficiencia de los que actualmente se utilizan métodos / biomarcadores para la detección de enfermedades, el diagnóstico, el pronóstico y el tratamiento 2. Métodos de detección actuales incluyen antígeno (PSA) prostático específico y un examen rectal digital (DRE), seguido de las biopsias de próstata 3. Antígeno específico de próstata (PSA) es el biomarcador de cáncer de próstata más ampliamente utilizado que ha revolucionado significativamente la gestión clínica y la mejora de las tasas de supervivencia 4. Sin embargo, debido a las limitaciones inherentes de PSA incluyendo lack de especificidad, cribado basado en PSA ha llevado a más de diagnóstico y sobre el tratamiento de la enfermedad. En vista de esto, los intensos esfuerzos se dirigen hacia la búsqueda de alternativas biomarcadores de cáncer de próstata, en particular los que puede predecir la agresividad de la enfermedad y conducir mejores decisiones de tratamiento 4,5. En los últimos años, los microRNAs (miRNAs) han surgido como prometedores biomarcadores de cáncer de próstata alternos.
Los microARNs (miRNAs) constituyen una clase conservado evolutivamente de los pequeños RNAs no codificantes que suprimen la expresión de genes post-transcripcional a través de interacciones específicas de secuencia con los 3'-regiones no traducidas (UTRs) de mRNA objetivos afines. Se estima que> 60% de los mRNAs se conservan objetivos de miRNAs 6. genes miARN se encuentran en regiones intergénicas o dentro de intrones o exones de proteína / no proteico 7 genes de codificación. Estos genes son preferentemente transcritos por la ARN polimerasa II en primamiRNAs ry (pri-miRNAs, varias kilobases de largo) que bucle tallo en forma de estructuras secundarias forma de horquilla. Estos pri-miRNAs se procesan en miRNAs precursores (pre-miRNAs, 60-75 nucleótidos de largo) que se exportan al citoplasma y tratados posteriormente en miRNAs maduros (18-25 nucleótidos de largo) 08.10. miRNAs regulan procesos celulares clave, incluyendo la proliferación, el desarrollo, la diferenciación y la apoptosis 11. Los estudios sugieren una desregulación generalizada de los perfiles de expresión de miRNA en diversos tumores malignos humanos incluyendo el cáncer de próstata 12-15. los perfiles de expresión de genes miARN se han notificado a ser ampliamente desregulado en el cáncer de próstata primario y metastásico. Alterada la expresión de miRNA se han relacionado con la progresión del cáncer de próstata, la agresividad y la recurrencia destacando el potencial pronóstico de miRNAs 12,14,16-19. Un creciente cuerpo de evidencia indica que los miRNAs juegan importantes papeles mecanicistas en la iniciación del cáncer de próstata, el desarrollo, el progresoion y la metástasis. En general, los miRNAs están surgiendo alternativas como biomarcadores prometedores para el diagnóstico del cáncer de próstata y el pronóstico que pueden distinguir entre los tejidos y ayuda normales y cancerosas en la estratificación de los tumores de próstata 12. También, miRNAs son objetivos importantes para el desarrollo de terapias eficaces contra el cáncer de próstata 20.
Debido a su pequeño tamaño y resistencia a la actividad de RNasa endógena, miRNAs son biomarcadores estables que se pueden detectar fácilmente en tejidos fijados con formalina y 21 en las biopsias de próstata 22. Por otra parte, los perfiles de expresión de miRNAs se han comparado en los tejidos congelados y formol fija y se han encontrado para ser fuertemente correlacionada 21. Sin embargo, la expresión de los genes miARN perfiles en los tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata a menudo es un reto debido a la heterogeneidad del tumor, los errores de muestreo, la contaminación del estroma etc. El desarrollo de miRNAs como biomarcadores eficaces para el cáncer de próstata en gran medida relies en su detección precisa en tejidos clínicos. Aquí se describe un flujo de trabajo simplificado utilizado en nuestro laboratorio para la expresión de los genes miARN perfiles de FFPE archivado o especímenes clínicos sobre el cáncer de próstata congelados frescos. Empleamos una combinación de PCR cuantitativa en tiempo real e hibridación in situ para miRNA los análisis de muestras clínicas, con el primero produciendo más información cuantitativa y el segundo para la visualización de la expresión diferencial de los genes miARN potenciales biomarcadores en una variedad de tejidos. Dentro de este flujo de trabajo, optimizamos las metodologías existentes para la extracción de miARN de FFPE y tejidos de la próstata congelados, la expresión análisis por Taqman-sonda basada miARN RT-PCR y miARN en la técnica de hibridación in situ utilizando ácido nucleico bloqueado (LNA) a base de sondas 23. Sondas basados en LNA ofrecen mayor sensibilidad y especificidad en comparación con el ADN o ARN-sondas basadas y permite la detección robusta de todas las secuencias de genes miARN, independientemente de su contenido de GC y también permiten la discriminaciónción de las familias miARN. Nuestro protocolo miRNA ISH optimizado se puede aplicar a las diapositivas de cáncer de próstata de tejido o microarrays de tejidos de cáncer de próstata (TMA), con este último ofrece el potencial para acelerar el descubrimiento de biomarcadores miRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo se describe un flujo de trabajo simplificado para la expresión de los genes miARN perfiles de FFPE archivado o tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata congelados frescos. En el cáncer de próstata, varios estudios sugieren un papel importante de microRNAs en cáncer de próstata iniciación, progresión y metástasis. Sin embargo, los resultados en conflicto a menudo se obtuvieron en un miRNA específico 22 desde la extracción y análisis de miRNA métodos difieren ampliamente. En…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Roger Erickson por su apoyo y asistencia en la preparación del manuscrito.
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud
(Número de Grant RO1CA177984; RO1CA138642), el proyecto de programa de VA sobre el cáncer de próstata (BX001604).
Materials
| Microtome | Leica Biosystems | RM2255 | |
| Arcturus Autopix for LCM | Arcturus/ Life Technologies | LCM1621/LCM1110 | Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| miRNeasy FFPE Kit | Qiagen | 217504 | |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4351106 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR master mix | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4352042 | |
| DIG labeled LNA probe for U6 | Exiqon | 99002-01 | |
| BM Purple AP substrate | Roche | 11442074001 | |
| Pre-hybridization solution | Biochain | K2191050-1 | |
| Hybridization solution | Biochain | K2191050-2 | |
| Blocking solution | Biochain | K2191050-8 | |
| AP-conjugated anti-digoxigenin antibody | Biochain | K2191050-7 | |
| Aqueous mounting media | Vector Laboratories | H-5501 | |
| Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent) | Life Technologies | 15596-018 | |
| Harris hematoxylin | Statlab | SL200 | |
| Eosin | Statlab | SL201 |
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