Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.
Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model. In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an in vivo model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.
Mycobacterium abscessus er en ny patogen, der forårsager et bredt spektrum af kliniske syndromer hos mennesker. Disse omfatter kutane infektioner samt alvorlige kroniske lungeinfektioner, for det meste er stødt på i immunkompromitterede og fibrose patienter 1,2,3,4 cystiske. M. abscessus er også betragtes som en større hastigt voksende mykobakteriestammer ansvar for nosokomielle og iatrogene infektioner hos mennesker. Desuden adskillige nylige rapporter fremhævet muligheden for, at M. abscessus kunne krydse blod-hjerne-barrieren og inducerer vigtige læsioner i centralnervesystemet (CNS) 5,6. Trods en hurtig producenten, M. abscessus udstiller også flere patogene funktioner, der er relateret til de af Mycobacterium tuberculosis, herunder evnen til at forblive tavs i årevis inden granulomatøse strukturer og skabe caseøs læsioner i lungerne 7. Mere alarmerende er den lave sensomhed af M. abscessus for antibiotika, hvilket gør ekstremt vanskelige at behandle, der fører til en betydelig terapeutisk fejlrate 8,9 disse infektioner. Det vigtige trussel for denne art er primært dens iboende resistens over for antibiotika, som er af stor bekymring i sundhedsinstitutioner offentlige 10 og en kontraindikation for lungetransplantation 11.
M. abscessus skærme glat (S) eller ru (R) koloni morphotypes der fører til forskellige kliniske resultater. I modsætning til S-stammen, R bakterier har en tendens til at vokse ende til anden, hvilket fører til et reb eller snor-lignende struktur 12,13. Flere uafhængige studier baseret på enten cellulære eller dyremodeller afslørede hyper-virulens fænotype af R morphotype 14,15. Fra epidemiologiske undersøgelser, de mest alvorlige tilfælde af M. abscessus lungeinfektioner synes at være forbundet med R varianter 16, som er den eneste variant,er blevet set at vare i årevis i en inficeret vært 3. Den morphotype Forskellen er afhængig af tilstedeværelsen (i S) eller tab (i R) af overflade-associerede glycopeptidolipids (GPL) 12. Men på grund af de iboende begrænsninger ved de i øjeblikket tilgængelige cellulære / dyremodeller anvendt til at undersøge M. abscessus infektion, vores viden om de patofysiologiske begivenheder R eller S-varianter er fortsat uklar. Infektion af immuno-kompetent mus via intravenøs eller aerosol ruter fører til forbigående kolonisering, hæmmer brugen af mus for at studere vedvarende infektioner og til in vivo narkotika resistensbestemmelse 17. Og derfor udvikle dyremodeller modtagelige for manipulering af værtens respons er en stor udfordring. I denne sammenhæng har ikke-pattedyr modeller for infektion er udviklet for nylig, herunder Drosophila melanogaster 18, der byder på flere fordele, såsom omkostninger, hastighed og etisk acceptable over musemodellen. Zebrafisk (Danio rerio) model for infektion er også blevet undersøgt for at visualisere, af ikke-invasiv billeddannelse, progression og kronologi M. abscessus infektion i et levende dyr 19. Vigtigere blev en proof of concept også etableret for at vise sin egnethed til in vivo antibiotisk vurderinger mod M. abscessus 17,20.
Zebrafisken er ofte blevet brugt i løbet af de sidste to årtier til at studere samspillet mellem forskellige patogener og værtens immunsystem 21. Den stigende succes denne alternative hvirveldyr model bygger på store og unikke muligheder, der motiverede og validerede dets anvendelse til en bedre forståelse af talrige virale og bakterielle infektioner 19,22,23,24,25,26,27,28,29. I modsætning til de fleste andre dyremodeller, zebrafisk embryoner er optisk transparente, tillader ikke-invasiv fluorescensbilleddannelse 30. Dette has ført til at studere M. abscessus inficeret zebrafisk embryoner med hidtil usete detaljer, der kulminerede med beskrivelsen af ekstracellulær Cording, der repræsenterer et eksempel på bakteriel morfologiske plasticitet. Cording repræsenterer en ny mekanisme for undergravning af immunsystemet og en nøglemekanisme fremme patogenesen af akut M. abscessus infektion 19.
Denne rapport beskriver nye værktøjer og metoder ved hjælp af zebrafisk embryo at dechifrere de patofysiologiske træk af M. abscessus infektion og for at undersøge intime interaktioner mellem baciller og det medfødte immunsystem. Først en detaljeret mikroinjektion protokol, der omfatter behandling af bakterielle inokulum, forberedelse embryo, og infektion i sig selv, præsenteres. Metoder specifikt tilpasset til at vurdere M. abscessus virulens ved at måle forskellige parametre, såsom vært overlevelse og bakteriel belastning, præsenteres. Der lægges særlig fokus på, hvordanat overvåge, på et spatiotemporale plan, skæbne og progression af infektion og værtens immunrespons til M. abscessus hjælp af video mikroskopi. Desuden at undersøge bidrag og rolle makrofager under M. abscessus infektion, metoder generere makrofager-forarmet embryoner (ved hjælp af enten genetically- eller kemisk-baserede tilgange) er beskrevet. Endelig protokoller visualisere de specifikke interaktioner med makrofager eller neutrofiler hjælp enten faste eller levende fostre er dokumenteret.
Formålet med denne rapport er at stimulere yderligere undersøgelser for at kaste nyt lys ind i M. abscessus virulens mekanismer og især rolle Cording i etableringen af en akut og ukontrolleret infektion proces.
Zebrafisken har for nylig vist sig at være en fremragende hvirveldyr modelsystem til undersøgelse dynamikken i bakteriel infektion ved hjælp af bredt felt og konfokal billeddannelse i realtid 36. Kombinationen af spredte mycobakterielle suspensioner (protokol 2.2) sammen med mikro-injektion metoder (protokol 4) giver reproducerbare systemiske infektioner og efterfølgende overvågning og visualisering af progression af infektion med særlig fokus på de bakterielle interaktioner med værten makrofage…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er taknemmelige for K. Kissa til nyttige diskussioner og for at tilvejebringe lipo-clodronat og L. Ramakrishnan for den generøse gave pTEC27 og pTEC15 der tillader ekspressionen af tdTomato og Wasabi, hhv. Dette arbejde er en del af projekterne i den franske National Research Agency (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 og DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) og Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram (FP7-PEOPLE-2011-ITN) under tilskudsaftale nr. PITN-GA-2011-289209 for Marie-Curie Initial Training Network FishForPharma. Vi vil også gerne takke foreningen Gregory Lemarchal og vaincre La mucoviscidose (RF20130500835) til finansiering af CM Dupont.
BBL MGIT PANTA | BD Biosciences | 245114 | |
Bovine Serum Albumin | Euromedex | 04-100-811-E | |
Catalase from Bovine Liver | Sigma-Aldrich | C40 | |
Difco Middlebrook 7H10 Agar | BD Biosciences | 262710 | |
Difco Middlebrook 7H9 Broth | BD Biosciences | 271310 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Oleic Acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
Paraformaldehyde | Delta Microscopie | 15710 | |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | 319244 | |
Tween 80 | Sigma-Aldrich | P4780 | |
Agar | Gibco Life Technologie | 30391-023 | |
Low melting agarose | Sigma-Aldrich | ||
Instant Ocean Sea Salts | Aquarium Systems Inc | ||
Borosilicate glass capillaries | Sutter instrument Inc | BF100-78-10 | 1mm O.D. X 0.78 mm I.D. |
Micropipette puller device | Sutter Instrument Inc | Flamming/Brown Micropipette Puller p-87 | |
Microinjector | Tritech Research | Digital microINJECTOR, MINJ-D | |
Tweezers | Sciences Tools inc | Dumont # M5S | |
Microloader Tips | Eppendorf |