JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
면역학 및 감염병학

Dechifrere og Imaging Patogenese og Cording af<em> Mycobacterium abscessus</em> I zebrafisk embryoner

Published: September 09, 2015
doi:
10.3791/53130
, , , , ,
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535,Université Montpellier, 2Centre d’études d’agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689,Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM,Université Versailles St Quentin

Summary

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Abstract

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model. In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an in vivo model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Introduction

Mycobacterium abscessus er en ny patogen, der forårsager et bredt spektrum af kliniske syndromer hos mennesker. Disse omfatter kutane infektioner samt alvorlige kroniske lungeinfektioner, for det meste er stødt på i immunkompromitterede og fibrose patienter 1,2,3,4 cystiske. M. abscessus er også betragtes som en større hastigt voksende mykobakteriestammer ansvar for nosokomielle og iatrogene infektioner hos mennesker. Desuden adskillige nylige rapporter fremhævet muligheden for, at M. abscessus kunne krydse blod-hjerne-barrieren og inducerer vigtige læsioner i centralnervesystemet (CNS) 5,6. Trods en hurtig producenten, M. abscessus udstiller også flere patogene funktioner, der er relateret til de af Mycobacterium tuberculosis, herunder evnen til at forblive tavs i årevis inden granulomatøse strukturer og skabe caseøs læsioner i lungerne 7. Mere alarmerende er den lave sensomhed af M. abscessus for antibiotika, hvilket gør ekstremt vanskelige at behandle, der fører til en betydelig terapeutisk fejlrate 8,9 disse infektioner. Det vigtige trussel for denne art er primært dens iboende resistens over for antibiotika, som er af stor bekymring i sundhedsinstitutioner offentlige 10 og en kontraindikation for lungetransplantation 11.

M. abscessus skærme glat (S) eller ru (R) koloni morphotypes der fører til forskellige kliniske resultater. I modsætning til S-stammen, R bakterier har en tendens til at vokse ende til anden, hvilket fører til et reb eller snor-lignende struktur 12,13. Flere uafhængige studier baseret på enten cellulære eller dyremodeller afslørede hyper-virulens fænotype af R morphotype 14,15. Fra epidemiologiske undersøgelser, de mest alvorlige tilfælde af M. abscessus lungeinfektioner synes at være forbundet med R varianter 16, som er den eneste variant,er blevet set at vare i årevis i en inficeret vært 3. Den morphotype Forskellen er afhængig af tilstedeværelsen (i S) eller tab (i R) af overflade-associerede glycopeptidolipids (GPL) 12. Men på grund af de iboende begrænsninger ved de i øjeblikket tilgængelige cellulære / dyremodeller anvendt til at undersøge M. abscessus infektion, vores viden om de patofysiologiske begivenheder R eller S-varianter er fortsat uklar. Infektion af immuno-kompetent mus via intravenøs eller aerosol ruter fører til forbigående kolonisering, hæmmer brugen af mus for at studere vedvarende infektioner og til in vivo narkotika resistensbestemmelse 17. Og derfor udvikle dyremodeller modtagelige for manipulering af værtens respons er en stor udfordring. I denne sammenhæng har ikke-pattedyr modeller for infektion er udviklet for nylig, herunder Drosophila melanogaster 18, der byder på flere fordele, såsom omkostninger, hastighed og etisk acceptable over musemodellen. Zebrafisk (Danio rerio) model for infektion er også blevet undersøgt for at visualisere, af ikke-invasiv billeddannelse, progression og kronologi M. abscessus infektion i et levende dyr 19. Vigtigere blev en proof of concept også etableret for at vise sin egnethed til in vivo antibiotisk vurderinger mod M. abscessus 17,20.

Zebrafisken er ofte blevet brugt i løbet af de sidste to årtier til at studere samspillet mellem forskellige patogener og værtens immunsystem 21. Den stigende succes denne alternative hvirveldyr model bygger på store og unikke muligheder, der motiverede og validerede dets anvendelse til en bedre forståelse af talrige virale og bakterielle infektioner 19,22,23,24,25,26,27,28,29. I modsætning til de fleste andre dyremodeller, zebrafisk embryoner er optisk transparente, tillader ikke-invasiv fluorescensbilleddannelse 30. Dette has ført til at studere M. abscessus inficeret zebrafisk embryoner med hidtil usete detaljer, der kulminerede med beskrivelsen af ekstracellulær Cording, der repræsenterer et eksempel på bakteriel morfologiske plasticitet. Cording repræsenterer en ny mekanisme for undergravning af immunsystemet og en nøglemekanisme fremme patogenesen af akut M. abscessus infektion 19.

Denne rapport beskriver nye værktøjer og metoder ved hjælp af zebrafisk embryo at dechifrere de patofysiologiske træk af M. abscessus infektion og for at undersøge intime interaktioner mellem baciller og det medfødte immunsystem. Først en detaljeret mikroinjektion protokol, der omfatter behandling af bakterielle inokulum, forberedelse embryo, og infektion i sig selv, præsenteres. Metoder specifikt tilpasset til at vurdere M. abscessus virulens ved at måle forskellige parametre, såsom vært overlevelse og bakteriel belastning, præsenteres. Der lægges særlig fokus på, hvordanat overvåge, på et spatiotemporale plan, skæbne og progression af infektion og værtens immunrespons til M. abscessus hjælp af video mikroskopi. Desuden at undersøge bidrag og rolle makrofager under M. abscessus infektion, metoder generere makrofager-forarmet embryoner (ved hjælp af enten genetically- eller kemisk-baserede tilgange) er beskrevet. Endelig protokoller visualisere de specifikke interaktioner med makrofager eller neutrofiler hjælp enten faste eller levende fostre er dokumenteret.

Formålet med denne rapport er at stimulere yderligere undersøgelser for at kaste nyt lys ind i M. abscessus virulens mekanismer og især rolle Cording i etableringen af en akut og ukontrolleret infektion proces.

Protocol

Zebrafisk eksperimentelle procedurer skal være i overensstemmelse med de relevante institutionelle og statslige regler. For den nuværende undersøgelse blev zebrafisk eksperimenter udført på University Montpellier, i henhold til EU-retningslinier for håndtering af forsøgsdyr (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) og godkendt i henhold til henvisningen CEEA-LR-13007. 1. Forberedelse af reagenser og Mikroinjektion Udstyr Forbered fiskevand ved at o…

Representative Results

Selv om forskellige anatomiske steder kan injiceres 32, er halevenen injektioner ofte bruges til at generere systemisk infektion for efterfølgende analyser, herunder overlevelse eksperimenter, bakteriebyrden bestemmelse, fagocytose aktivitet eller ledningen formation. Injektioner i halemusklerne anvendes til at vurdere ansættelse af makrofager på injektionsstedet (figur 3A). For at undersøge og sammenligne virulensen af R- og S-varianter af M. abscessus, er fluorescerende bakteri…

Discussion

Zebrafisken har for nylig vist sig at være en fremragende hvirveldyr modelsystem til undersøgelse dynamikken i bakteriel infektion ved hjælp af bredt felt og konfokal billeddannelse i realtid 36. Kombinationen af ​​spredte mycobakterielle suspensioner (protokol 2.2) sammen med mikro-injektion metoder (protokol 4) giver reproducerbare systemiske infektioner og efterfølgende overvågning og visualisering af progression af infektion med særlig fokus på de bakterielle interaktioner med værten makrofage…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne er taknemmelige for K. Kissa til nyttige diskussioner og for at tilvejebringe lipo-clodronat og L. Ramakrishnan for den generøse gave pTEC27 og pTEC15 der tillader ekspressionen af ​​tdTomato og Wasabi, hhv. Dette arbejde er en del af projekterne i den franske National Research Agency (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 og DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) og Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram (FP7-PEOPLE-2011-ITN) under tilskudsaftale nr. PITN-GA-2011-289209 for Marie-Curie Initial Training Network FishForPharma. Vi vil også gerne takke foreningen Gregory Lemarchal og vaincre La mucoviscidose (RF20130500835) til finansiering af CM Dupont.

Materials

BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
  2. Aitken, M. L., Limaye, A., et al. Respiratory outbreak of Mycobacterium abscessus subspecies massiliense in a lung transplant and cystic fibrosis center. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 185 (2), 231-232 (2012).
  3. Gilljam, M., Lindblad, A., Ridell, M., Wold, A. E., Welinder-Olsson, C. Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1497-1504 (2007).
  4. Roux, A. -. L., Catherinot, E., et al. Multicenter study of prevalence of nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis in France. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4124-4128 (2009).
  5. Lee, M. -. R., Cheng, A., et al. CNS infections caused by Mycobacterium abscessus complex: clinical features and antimicrobial susceptibilities of isolates. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (1), 222-225 (2012).
  6. Talati, N. J., Rouphael, N., Kuppalli, K., Franco-Paredes, C. Spectrum of CNS disease caused by rapidly growing mycobacteria. The Lancet Infectious Diseases. 8 (6), 390-398 (2008).
  7. Medjahed, H., Gaillard, J. -. L., Reyrat, J. -. M. Mycobacterium abscessus: a new player in the mycobacterial field. Trends in Microbiology. 18 (3), 117-123 (2010).
  8. Griffith, D. E., Girard, W. M., Wallace, R. J. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1271-1278 (1993).
  9. Nessar, R., Cambau, E., Reyrat, J. M., Murray, A., Gicquel, B. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (4), 810-818 (2012).
  10. Sanguinetti, M., Ardito, F., et al. Fatal pulmonary infection due to multidrug-resistant Mycobacterium abscessus a patient with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 39 (2), 816-819 (2001).
  11. Griffith, D. E., Aksamit, T., et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 175 (4), 367-416 (2007).
  12. Howard, S. T., Rhoades, E., et al. Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus a smooth to a rough morphotype is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and reacquisition of an invasive phenotype. Microbiology (Reading, England). 152 (Pt 6), 1581-1590 (2006).
  13. Chardi, A., Olivares, F., Byrd, T. F., Julián, E., Brambilla, C., Luquin, M. Demonstration of cord formation by rough Mycobacterium abscessus variants: implications for the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 49 (6), 2293-2295 (2011).
  14. Byrd, T. F., Lyons, C. R. Preliminary characterization of a Mycobacterium abscessus mutant in human and murine models of infection. Infection and Immunity. 67 (9), 4700-4707 (1999).
  15. Catherinot, E., Clarissou, J., et al. Hypervariance of a rough variant of the Mycobacterium abscessus type strain. Infection and Immunity. 75 (2), 1055-1058 (2007).
  16. Catherinot, E., Roux, A. -. L., et al. Acute respiratory failure involving an R variant of Mycobacterium abscessus. Journal of Clinical Microbiology. 47 (1), 271-274 (2009).
  17. Bernut, A., Le Moigne, V., Lesne, T., Lutfalla, G., Herrmann, J. -. L., Kremer, L. In vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium abscessus using the embryonic zebrafish test system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 4054-4063 (2014).
  18. Oh, C. -. T., Moon, C., Jeong, M. S., Kwon, S. -. H., Jang, J. Drosophila melanogaster for Mycobacterium abscessus infection. Microbes and Infection / Institut Pasteur. 15 (12), 788-795 (2013).
  19. Bernut, A., Herrmann, J. -. L., et al. Mycobacterium abscessus cording prevents phagocytosis and promotes abscess formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), E943-E952 (2014).
  20. Dubée, V., Bernut, A., et al. β-Lactamase inhibition by avibactam in Mycobacterium abscessus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (4), 1051-1058 (2015).
  21. Torraca, V., Masud, S., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Macrophage-pathogen interactions in infectious diseases: new therapeutic insights from the zebrafish host model. Disease Models Mechanisms. 7 (7), 785-797 (2014).
  22. Alibaud, L., Rombouts, Y., et al. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Molecular Microbiology. 80 (4), 919-934 (2011).
  23. Clay, H., Volkman, H. E., Ramakrishnan, L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death. Immunity. 29 (2), 283-294 (2008).
  24. Palha, N., Guivel-Benhassine, F., et al. Real-time whole-body visualization of Chikungunya Virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathogens. 9 (9), e1003619 (2013).
  25. Mostowy, S., Boucontet, L., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS pathogens. 9 (9), e1003588 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10 (11), 2312-2325 (2008).
  27. Van der Sar, A. M., Appelmelk, B. J., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Bitter, W. A star with stripes: zebrafish as an infection model. Trends in Microbiology. 12 (10), 451-457 (2004).
  28. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infection and Immunity. 78 (4), 1495-1508 (2010).
  29. Levraud, J. -. P., Disson, O., et al. Real-time observation of Listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infection and Immunity. 77 (9), 3651-3660 (2009).
  30. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
  31. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  32. Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  33. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 83-93 (1994).
  34. Adams, K. N., Takaki, K., et al. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145 (1), 39-53 (2011).
  35. Ramakrishnan, L. Looking within the zebrafish to understand the tuberculous granuloma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 783, 251-266 (2013).
  36. Davis, J. M., Clay, H., Lewis, J. L., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of Mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  37. Lamason, R. L., Mohideen, M. -. A. P. K., et al. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science (New York, NY). 310 (5755), 1782-1786 (2005).
  38. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  39. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC developmental biology. 7, 42 (2007).
  40. Takaki, K., Davis, J. M., Winglee, K., Ramakrishnan, L. Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum in zebrafish. Nature Protocols. 8 (6), 1114-1124 (2013).
  41. Stoop, E. J. M., Schipper, T., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Models Mechanisms. 4 (4), 526-536 (2011).
  42. Carvalho, R., de Sonneville, J., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PloS One. 6 (2), e16779 (2011).

Tags

ZebrafishMycobacterium AbscessusInfection ModelHost-pathogen InteractionsFluorescent BacteriaMacrophagesCordingAbscess FormationVirulenceImagingFluorescence Microscopy
check_url/kr/53130?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image