Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.
Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model. In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an in vivo model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.
Mycobacterium abscessus är en framväxande patogen som orsakar ett brett spektrum av kliniska syndrom hos människor. Dessa inkluderar hudinfektioner samt svåra kroniska lunginfektioner, oftast påträffas i nedsatt immunförsvar och patienter med cystisk fibros 1,2,3,4. M. abscessus betraktas också som en stor snabbväxande mycobakteriearter ansvarar för nosokomiala och iatrogena infektioner hos människor. Dessutom betonade flera färska rapporter möjligheten att M. abscessus kunde korsa blod-hjärnbarriären och inducera viktiga lesioner i det centrala nervsystemet (CNS) 5,6. Trots att en snabb odlare, M. abscessus utställningar också flera patogena funktioner som är relaterade till de av Mycobacterium tuberculosis, inklusive förmågan att tiga i flera år inom granulomatösa strukturer och generera Kaseös lesioner i lungorna 7. Mer oroväckande är den låga sensitivity för M. abscessus mot antibiotika, vilket gör dessa infektioner extremt svåra att behandla som leder till en väsentlig terapeutisk felfrekvens 8,9. Det viktiga hot av denna art är främst dess inneboende resistens mot antibiotika, vilket är av stor betydelse i offentliga vårdinrättningar 10 och en kontraindikation för lungtransplantation 11.
M. abscessus visar släta (S) eller grova (R) koloni morphotypes som leder till olika kliniska resultat. I motsats till S-stammen, R bakterier har en tendens att växa ände mot ände, vilket leder till ett rep eller en lina liknande struktur 12,13. Flera oberoende studier baserade på antingen cellulära eller djurmodeller avslöjade hyper virulens fenotyp av R morphotype 14,15. Från epidemiologiska studier, de mest allvarliga fallen av M. abscessus lunginfektioner verkar vara förknippade med R-varianter 16 som är den enda variant somhar sett att bestå i flera år i en infekterad värd 3. Den morphotype skillnaden är beroende av närvaro (i S) eller förlust (i R) av ytan associerade glycopeptidolipids (GPL) 12. Men på grund av de inneboende begränsningarna hos de för närvarande tillgängliga cellulära / djurmodeller för att studera M. abscessus infektion, vår kunskap om de patofysiologiska händelser R eller S-varianter förblir oklar. Infektion av immunkompetenta möss via intravenösa eller aerosoler vägar leder till övergående kolonisation, hindrar användningen av möss för att studera ihållande infektioner och för in vivo drogresistensbestämning 17. Därför utvecklar djurmodeller kan bli föremål för manipulation av värdsvaret är en stor utmaning. I detta sammanhang har icke-däggdjurs modeller infektions nyligen utvecklats, inklusive Drosophila melanogaster 18 som erbjuder flera fördelar såsom kostnad, snabbhet och etiska godtagbarhet over musmodellen. Zebrafisk (Danio rerio) modell av infektion har även undersökts för att visualisera, icke-invasiv bildbehandling, utvecklingen och kronologi över M. abscessus infektion hos ett levande djur 19. Det är viktigt att en proof of concept konstaterades också att visa sin lämplighet för antibiotika bedömningar in vivo mot M. abscessus 17,20.
Zebrafisk har använts i stor utsträckning under de senaste två decennierna för att studera samspelet mellan olika patogener och värdens immunsystem 21. Den ökande framgången för denna alternativa ryggradsdjur modell bygger på stora och unika möjligheter som motiverade och validerade dess användning för en bättre förståelse av många virus- och bakterieinfektioner 19,22,23,24,25,26,27,28,29. Till skillnad från de flesta andra djurmodeller, zebrafisk embryon är optiskt transparenta, vilket gör att icke-invasiv fluorescens avbildning 30. Detta utmärs ledde till studera M. abscessus infekterade zebrafisk embryon med oöverträffade detaljer, som kulminerade med beskrivningen av extracellulära ligt, som representerar ett exempel på bakteriell morfologisk plasticitet. Cording representerar en ny mekanism för underminering av immunsystemet och en nyckelmekanism främja patogenes av akut M. abscessus infektion 19.
Denna rapport beskriver nya verktyg och metoder med hjälp av zebrafisk embryot att dechiffrera patofysiologiska drag av M. abscessus infektion och att studera intima samspelet mellan baciller och det medfödda immunförsvaret. Först, en detaljerad mikroinjektion protokoll som inkluderar hanterande av den bakteriella ympen, embryo förberedelser, och infektion i sig, presenteras. Metoder särskilt anpassat för att bedöma M. abscessus virulens genom att mäta olika parametrar, såsom värd överlevnad och bakteriell belastning, presenteras. Särskilt fokus ges på huratt övervaka, vid en spatiotemporal nivå, ödet och progression av infektionen och värdens immunsvar på M. abscessus hjälp av video mikroskopi. Dessutom, för att undersöka bidrag och roll makrofager under M. abscessus infektion, metoder generera makrofager-utarmat embryon (med antingen genetically- eller kemiskt baserade metoder) beskrivs. Slutligen protokoll visualisera specifika interaktioner med makrofager eller neutrofiler använder antingen fasta eller levande embryon dokumenteras.
Syftet med denna rapport är att stimulera ytterligare undersökningar för att kasta nytt ljus i M. abscessus virulens mekanismer och särskilt den roll som ligt i upprättandet av en akut och okontrollerad infektionsprocessen.
Den zebrafisk har nyligen dykt upp som en utmärkt ryggradsdjur modellsystem för att studera dynamiken i bakteriell infektion med hjälp av brett fält och konfokal avbildning i realtid 36. Kombinationen av spridda mykobakteriella suspensioner (protokoll 2.2) tillsammans med mikroinjektion metoder (protokoll 4) medger reproducerbara systemiska infektioner, och efterföljande övervakning och visualisering av utvecklingen av infektion med en särskild inriktning på de bakteriella interaktioner med värdmakro…
The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksamma till K. Kissa för hjälpsamma diskussioner och för att åstadkomma lipo-klodronat och L. Ramakrishnan för den generösa gåvan av pTEC27 och pTEC15 som tillåter uttryck av tdTomato och Wasabi, respektive. Detta arbete är en del av projekten i den franska nationella forskningsinstitut (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 och DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) och Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram (FP7-PEOPLE-2011-ITN) enligt bidragsavtal nr. PITN-GA-2011-289209 för Marie Curie Initial Training Network FishForPharma. Vi vill också tacka Association Gregory Lemarchal och Vaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) för att finansiera CM Dupont.
BBL MGIT PANTA | BD Biosciences | 245114 | |
Bovine Serum Albumin | Euromedex | 04-100-811-E | |
Catalase from Bovine Liver | Sigma-Aldrich | C40 | |
Difco Middlebrook 7H10 Agar | BD Biosciences | 262710 | |
Difco Middlebrook 7H9 Broth | BD Biosciences | 271310 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Oleic Acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
Paraformaldehyde | Delta Microscopie | 15710 | |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | 319244 | |
Tween 80 | Sigma-Aldrich | P4780 | |
Agar | Gibco Life Technologie | 30391-023 | |
Low melting agarose | Sigma-Aldrich | ||
Instant Ocean Sea Salts | Aquarium Systems Inc | ||
Borosilicate glass capillaries | Sutter instrument Inc | BF100-78-10 | 1mm O.D. X 0.78 mm I.D. |
Micropipette puller device | Sutter Instrument Inc | Flamming/Brown Micropipette Puller p-87 | |
Microinjector | Tritech Research | Digital microINJECTOR, MINJ-D | |
Tweezers | Sciences Tools inc | Dumont # M5S | |
Microloader Tips | Eppendorf |