Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.
Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.
Etterforskerne har brukt en rekke dyremodeller for å studere normal funksjon av hørselssystemet samt patofysiologien av hørselstap. Disse modellene er også svært nyttig for å gjennomføre intervensjonsstudier mot ulike patologiske prosesser og tjene som grunnlag for translasjonsforskning applikasjoner i mennesker. For de fleste forskning som involverer sneglehuset og de tilhørende hørselsbanene, må en viss grad av skade eller avbrudd innføres i systemet. Ofte er skaden hensikt som mål å skape en bestemt lesjon, slik at forskere for å studere effekten av at lesjon på normal funksjon, så vel som cochlea evne til å gjenopprette fra den. Ved valg av en spesiell dyremodell og / eller teknikk (er) for innføring av skade, må betraktes som en rekke faktorer for å oppnå best mulige resultater. Ulike dyremodeller kan reagere forskjellig på tiltak, mens de direkte og indirekte effekter av en teknikk kan værehelt skadelige for det ønskede resultatet. I de fleste tilfeller vil den ideelle indre øret skade protokollen unngå systemisk toksisitet, raskt og sikkert gi skader, skape et presist og konsistent lesjon, og være overlevings til å se nøyere på funksjonelle, cellulære og molekylære endringer. Ideelt sett ville disse metodene også bevare den delikate mikroarkitektur og elektrokjemiske gradienter av sneglehuset i størst mulig grad.
Hittil har etterforskerne klart å etablere en rekke teknikker for å indusere indre øret skade. De fleste av disse innebære å utsette sneglehuset til en ototoxic middel enten systemisk eller via kirurgiske tilnærming. Teknikker inkluderer parenteral injeksjon, intra-peritoneal injeksjon, trans-tromme injeksjon, endolymfatiske sac injeksjon, og cochleostomy med perilymphatic perfusjon. Disse teknikker har vært brukt for å introdusere et utvalg av ototoksiske midler, så som furosemid, gentamicin, ouabain, og heptanol. 1-5Mens vellykket i å skape bestemte cochlea lesjoner, de ovennevnte teknikker også har erkjent begrensninger. Systemiske injeksjoner kan være svært giftig for dyr og kan være forbundet med utilsiktede cochlea fornærmelser og inkonsistente resultater. Den sistnevnte ulempe har også vært forbundet med trans-tromme injeksjoner. Teknikker som cochleostomy og perilymphatic perfusjon, mens evnen til å indusere hurtig og svært pålitelige lesjoner, er direkte invasiv til det indre øret struktur og funksjon. Mange av de kirurgiske tilnærminger er også forbundet med en høy grad av tekniske problemer, og kan kreve å forlate fremmedlegemer i dyret, for eksempel en mikropumpe infuser. 2-4,6-8 Ingen enkel teknikk er fri for svakheter, og etterforskerne må velge metoder nøye for å passe deres eksperimentelle behov. Her beskriver vi, i detalj, er det runde vindu nisje (RWN) påføringsteknikk for topisk levering av ototoksiske midler i voksne mus.
First beskrevet av Husmann et al i 1998, mens han studerte gentamicin effekt på sensoriske hårcelle degenerasjon i en avian modell, ble denne teknikken funnet å være i stand til å produsere betydelig mer pålitelige lesjoner enn systemisk gentamicin søknad, og samtidig unngå assosierte toksisitet. 9 Siden da en rekke andre forskere, inkludert vårt laboratorium, har brukt denne teknikken til stor suksess. I 2004 Heydt et al. tilpasset den til en musemodell og beskrevet en forbedret evne til å kontrollere lesjon størrelse ved å fylle RWN med absorberbare gelatin svamp dyppet i varierende konsentrasjoner av gentamicin. 10 Palmgren et al., i 2010, studerte ototoxic effekten av beta-Bungarotoxin, en potent element i giften fra Taiwan bundet kasse, ved å anvende en vandig form for det til RWN av voksne rotter. 11 I tillegg er en rekke tidligere undersøkelser fra vårt laboratorium anvendes det runde vindu tilnærming for å studere effektene av furosemid ototoxice, ouabain, og heptanol. 5,6,12-15 Resultatene fra disse studiene har vist betydningen av cochlea væske og ion homeostase på normal hørsel, oppdaget celleproliferativ evne i spiral ganglion og cochlea sidevegg, og fremmet vår forståelse av aldersrelatert hørselstap.
Følgende tilnærming innebærer kirurgisk tilgang til mellomøret via en postauricular snitt og delvis unroofing av benete tromme bulla. Dette gir god eksponering av RWN og membranen til hvilken et utvalgt ototoxic middel kan påføres direkte. Den flytende middel da bassenger i koppen-lignende hul av RWN (eller langsomt drenerer fra en mettet absorberbare gelatin svamp carrier pakket inn i RWN) og diffunderer gjennom det runde vinduet membranen inn i perilymphatic plass i cochlea vestibylen. Ingen direkte cochleostomy er gjort i denne tilnærmingen. Fordelene ved denne teknikken omfatter bevaring av det indre øret mikroarkitektur, unngåelseav systemisk toksisitet, innrømmelse av en intra-dyr kontroll øret, hurtig innsettende effekt, selektiv degenerasjon i visse cochlea celletyper (f.eks., type I spiral ganglion nevroner med ouabain eksponering og cochlea type II fibrocytt indusert ved behandling av heptanol), og reproduserbare / pålitelige resultater. Denne teknikk kan anvendes med noen få endringer mellom andre gnagerarter, deriblant rotter, marsvin, ørkenrotte og. Ulempene inkluderer en bratt teknisk læringskurve og den relative begrensning av ototoxic fornærmelse som er begrenset til et enkelt punkt i tid.
Protokollen og representative resultatene beskrevet over ble oppnådd i en CBA / Caj musemodell blant begge kjønn. Dette innavlet stamme er godt etablert som en "god hørsel" standard og "normal aldring" -modellen i å høre forskning. 16-23 beskrivelse av bruk av denne protokollen i andre pattedyr modeller er utenfor rammen av denne teksten. Leseren bør merke seg imidlertid at RWN påføringsteknikk gir flere fordeler å studere pattedyr indre øret. Av disse er det mest bemerkelsesverdige at den unngår direkte forstyrrelse av den delikate anatomisk struktur og biokjemiske gradienter som eksisterer innenfor murene til otic kapsel. Prosedyrer som cochleostomy og implantering av infusjonspumper har tilbøyelighet til å direkte krenke indre øret strukturer som fører til permanente terskel skift; et faktum som må tas i betraktning ved analyse av resultatene. Forstyrrelse av cochlea sideveggkonstruksjoner av invasiv methods kan også begrense bruken av ototoksiske midler slik som furosemid eller heptanol, som bestemt sone av effekten er begrenset til det stedet. 15,24 Alternative ikke-invasive metoder som trans-tromme injeksjon og parenteral injeksjon har vært plaget av upålitelige resultater og / eller systemisk toksisitet overfor dyremodell. Denne påføringsmetode har vist seg å unngå begge disse ulemper, å oppnå en grad av konsistens som nærmer seg de mer invasive metodene diskutert ovenfor.
Andre fordeler ved denne teknikken omfatter er dens brede anvendbarhet til en rekke dyremodeller og muligheten til å innlemme inn i et eksisterende laboratorieinfrastruktur. Når det gjelder sistnevnte, er ingen spesielle reagenser eller kjemikalier er nødvendig bortsett fra de valgte ototoxic midler, bedøvelsesmidler, og analgetika. Ototoxic midler benyttes typisk ved en fast konsentrasjon og blandes i et stort nok volum av oppløsning (5 ml) til å vare lengre tid vurdereing hvert program bruker omtrent 10 pl (hos mus). Dermed etter den første anskaffelse av utstyr og instrumenter, etterforskere er relativt fri for tidkrevende løsning forberedelse eller hyppig utskifting av materialer. Denne teknikken har også reduksjon i operativ tid, noe som kan ha betydning når sammenlignet med fremgangsmåter som omfatter implantering av perilymphatic infusjonspumper eller cochleostomies. Ved å nå et nivå på tekniske ferdigheter, våre gjennomsnittlig gjennomføringstid fra første snitt til nedleggelsen var typisk 20 min til 1,5 timer, avhengig av lengden av eksponering er ønsket for ototoxic agent. Tre eller fire operasjoner kan lett bli ferdig i løpet av én dag, noe som åpner for økt effektivitet og økt potensial for å oppnå gode resultater. Som beskrevet ovenfor, denne teknikken kan også lett brukes på en rekke forskjellige gnagermodeller, inkludert mus, rotter, marsvin og ørkenrotte.
Begrensninger av denne metoden er sentrert påmoderat bratt læringskurve for å mestre det og redusert forventede resultater til teknisk ferdighet er nådd. Som skal diskuteres i mer detalj nedenfor, vil små feil i løpet av den kirurgiske metode eller utilstrekkelig visualisering av det kirurgiske felt nesten alltid føre til et dårlig resultat. Sparsomme funn at en nybegynner kan mislykkes i å gjenkjenne, for eksempel en sub-millimeter tykk luftboble blokkerer tilgangen av agenten til det runde vinduet membran eller interstitiell væske fortynne agent, ta deg tid til å sette pris på og utvikle de psykomotoriske ferdigheter som kreves for å korrigere dem. Men med gjentatt utførelse av fremgangsmåten disse hindringene er lett overvinnes, og utgjør en mindre krevende teknisk utfordring å undersøkere enn noen av de tidligere nevnte invasive metoder. Endelig er denne teknikken forbundet med relative begrensning at cochlea skade kan fremkalles bare ved et enkelt tidspunkt i løpet av den kirurgiske eksponering. Dette kan overvinnes i en viss grad, Ved å fylle RWN med absorberbare gelatin svamp fuktet i midlet som ble beskrevet av Heydt et al. 10 Den absorberbare gelatin svampen vil resorbere over tid, men kan gi rom for en lengre eksponeringsperiode enn det som er oppnåelig ved anvendelse av en vandig oppløsning alene.
For at en undersøker for å realisere den fulle fordeler ved denne teknikk og unngå eventuelle fallgruver, er det avgjørende å gjenkjenne de to kritiske elementer av denne teknikk: 1) den gjennomgående opprett visualisering av mellomøret plass og RWN; og 2) evne til å holde operasjonsområdet fritt for interstitiell væske og / eller blodet. I å oppnå den tidligere av disse, kan betydningen av en skikkelig head-holderen ikke understrekes sterkt nok. Sikker fiksering av dyrets hode sikrer en stabil visning under mikroskop; hvis betydning blir lett åpenbar når subtile instrumentering drastisk endrer plassering av strukturer under forstørrelse. En god head holder som kan rotere om dyrets rostrokaudale aksen forenkler også viktige dynamiske endringer i etterforskeren linje av nettstedet. Ofte kan et par millimeter rotasjon om denne akse bety forskjellen mellom visualisering av RWN og visualisering av bare otic kapselen benet. Muligheten til å stadig endre syn er også viktig å sikre interstitiell væske er fjernet fra dypet av nisje og også at ototoxic agenten er helt fjernet mellom programmer som omtalt i del 5. I vår erfaring, blod, kondens, eller interstitiell væske som kommer inn i mellomøret plass har evnen til å forstyrre hele eksperimentet. Dette er ikke overraskende, da den lille mengde av ototoxic middel påføres på det runde vindu (~ 10 mL) kan lett fortynnes ved å komme i kontakt med selv små mengder av overflødig væske. Av denne grunn, nitid kirurgisk disseksjon, stykkevis uncapping av tromme bulla og forsiktig preservation av stapedial arterie er ensbetydende med å en vellykket eksperimentelle resultater.
Hvis ovennevnte kritiske trinn er observert og forventede resultater er fortsatt ikke oppnådd, bør feilsøking starte. Etter vår erfaring er det ofte nyttig å utføre prøve varianter av to prosessuelle elementer. Den første er å endre hvor ofte den ototoxic agenten blir oppfylt i det runde vinduet. Avhengig av det middel som skal anvendes, er total eksponeringstid på mellom 30 min og 1 time, med fullstendig vekevirkende og påfølgende utskifting av midlet hvert 10 min. Hvis utsette for kortere varighet, kan øke den totale eksponeringen tillate agenten mer tid til å spre over det runde vinduet membran. Ytterligere eksponering og etterfylling kan også bidra til å unngå uønsket fortynning av ototoxic middel ved blod, kondensasjon, eller interstitiell som diskutert ovenfor. Forsiktighet bør opprettholdes ved bruk av denne tilnærmingen, men som det har en tendens til å øke risikoen for utilsiktetly skadet den stapedial arterie og / eller innføre interstitiell væske til RWN.
Denne teknikken er vesentlig i hva det tilbyr til undersøkelser av cochlea fysiologi og patofysiologi. Denne minimalt invasive teknikken tillater detaljert studie av delikate biokjemiske prosesser og har vært ensbetydende i å fremme vår forskning rettet mot å vurdere cochlea regenererende potensial. 12,24 Denne kirurgiske tilnærming og påvirkning er også gjengitt på tvers av en rekke andre avlegger teknikker, og vellykkede resultater ved hjelp av denne Metoden har blitt rapportert i studier av cochlea stamcelle implantasjon. 14 Mye er fortsatt ukjent om sneglehuset, men denne teknikken, sammen med bredere armamentarium tilgjengelig for etterforskere, vil hjelpe til å begrense dette kunnskapsgapet.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) Grant number: NIH P50DC00422 (H.L.); NIH R01DC12058 (H.L.). This work also benefitted from the South Carolina Clinical and Translational Research Institution (SCTR) Clinical and Translational Science Award (NIH/NCRR UL1RR029882). The funders had no role in study design, data collection, and/or analysis. The authors would like to thank Lonnie E. Brown Jr. for his artistic and graphic contributions.
1-Heptanol 98% | Sigma-Aldrich | H2805 | PubChem Substance ID 24895536 |
250ML | |||
Ketaset Injectable | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Concentrate 100mg/ml |
(Ketamine HCl) | 10ml | Schedule CIII controlled substance | |
Anased Injectable | Lloyd Laboratories | NADA# 139-236 | Concentrate 20mg/ml |
(Xylazine) | |||
Buprenex Injectable | Patterson Veterinary | 07-850-2280 | Concentrate 0.3mg/ml |
(Buprenorphine HCl) | 5 ampules per box | Schedule CIII controlled substance | |
Betadine Skin Prep Solution | Medline | MDS093941 | 1 Quart screw top bottle |
(Povidone-Iodine) | |||
0.9% Sterile Saline | Variable | N/A | For mixing solutions and injections |
Table of Equipment, Surgical Instruments, and Specific Techniques | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
Operating Microscope | Carl Zeiss | 32192 | |
Controlled Acoustics Environment Sound Booth | Industrial Acoustics Company | N/A | |
Surgical Head Holder | Custom Made – | Please see Figure 3 | |
Medical University of South Carolina | |||
Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75inch | World Precision Instruments | 555801L | Maximum spread 20mm |
Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder | |||
90N Dental Belt Driven Hand Drill | Emesco | N/A (Vintage Item) | |
Scalpel Handle Size6 | Bard-Parker | MEDC-011990 | |
#15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade | Bard-Parker | SKU: 097-7215 | 50 Blades/Box |
Via ACE Surgical Supply Code | |||
Straight Tip Jewelers Forceps | Bernell | MIL17304 | |
Iris Scissors Curved | Medline | DYND04026 | |
Iris Scissors Straight | Medline | DYND04025 | |
Stevens Tenotomy Scissors Straight | Medline | MDG3222111 | |
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip | MytaMed | Item# 6.56.00 | Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks |
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip | MytaMed | Item# 6.56.01 | |
Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | CODE 34155 | White, Size 4.4×8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks. |
House Ear Curette, 6” shaft, light angle | Medline | MDG0396486 | |
Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100 | Medline | IIS34201 | Substitutions may be made |
Cotton pellets #3 4mm | Richmond | Manufacturer Code 100108 | |
ElectroSurgical Unit 100 E M/M | Elmed | List No. 52-5770 | Bipolar and Monopolar Capable |
1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5” length needle | BD | Product Number: 329410 | Optional for delivery of Ototoxic agent |
23G, blunt tip, 1” length needle | Kendall | Product Code 8881202397 | For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery |
Surgical Mask | U-line | S-10478 | |
Exam Grade Nitrile Surgical Gloves | U-line | S-12549 | |
Precision Hair Clippers | Wahl | N/A | Multiple models may be substituted |
5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1 13mm 3/8 circle needle | Ethilon | 1855G | Substitutions may be made. |
Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisher | 01-812054 | |
Dry Sterilizer | ROBOZ | Germinator TM 500 | |