Die Nutzung der Ramsay Assay zu Flüssigkeitssekretion und Ionenfluss Preise in der Maßnahme<em> Drosophila melanogaster</em> Malpighischen Tubulus

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des Ramsay Assay Flüssigkeitssekretion Raten von isolierten Malpighischen (Nieren) Tubuli aus Drosophila melanogaster zu messen. Darüber hinaus ist die Verwendung von ionenspezifischen Elektroden, die Natrium- und Kaliumkonzentrationen in der sekretierten Flüssigkeit zu messen, mit Berechnung der transepithelialen Ionenfluss, wird beschrieben.

Abstract

Modulation Nierenepithelzellen Ionentransport erlaubt Organismen ionische und osmotische Homöostase angesichts der unterschiedlichen äußeren Bedingungen aufrechtzuerhalten. Die Drosophila melanogaster Malpighischen (Nieren) Tubulus bietet eine einmalige Gelegenheit, um die molekularen Mechanismen der epithelialen Ionentransport zu untersuchen, aufgrund der leistungsfähigen Genetik dieses Organismus und der Zugänglichkeit ihrer Nierentubuli auf physiologische Studie. Hier beschreiben wir die Verwendung des Ramsay Assayfluid Sekretionsraten von isolierten fly Nierentubuli zu messen, mit der Verwendung von ionenspezifischen Elektroden, die Natrium- und Kaliumkonzentrationen in der sekretierten Flüssigkeit zu messen. Dieser Assay ermöglicht Studium der transepithelialen Flüssigkeit und Ionenflüsse von ~ 20 Tubuli zu einer Zeit, ohne die Notwendigkeit, das sezernierte Fluid zu einer separaten Vorrichtung zu übertragen, um die Ionenkonzentration zu messen. Genetisch unterschiedlichen Tubuli können analysiert werden, um die Rolle spezifischer Gene, die in Transportprozessen zu beurteilen. Zusätzlich wird die bathing Salzlösung kann geändert werden, um die Wirkungen der chemischen Eigenschaften oder Arzneimittel oder Hormone zugesetzt untersuchen. Zusammenfassend ermöglicht diese Technik die molekulare Charakterisierung der Grundmechanismen von epithelialen Ionentransport in Drosophila Tubulus sowie Regelung dieser Transportmechanismen.

Introduction

Nierenepithelzellen Ionentransport zugrunde organismal iono- und Osmoregulation. Die Drosophila melanogaster Malpighischen (Nieren) Tubulus bietet eine einmalige Gelegenheit, um die molekularen Mechanismen der epithelialen Ionentransport zu studieren. Dies ist aufgrund der Kombination der leistungsfähigen Genetik von Drosophila, gepaart mit der Zugänglichkeit der Nierentubuli auf physiologische Studie. Die Ramsay Assay, nach dem Forscher, der die Technik ¹ Pionier benannt, misst Flüssigkeitssekretion Raten von isolierten Malpighischen, und wurde in Drosophila 1994 von Dow und Kollegen ² etabliert. Dies ebnete den Weg für weitere Studien unter Verwendung von Drosophila genetische Werkzeuge, wie beispielsweise die GAL4-UAS-System ^3,4, um zellspezifische Signalwege regulieren Flüssigkeitssekretion definieren. Ein Beispiel beinhaltet Calcium-Signal in Reaktion auf ein Peptidhormon, ^5, unter vielen anderen ^6,7.

ve_content "> eine Kombination von genetischen Techniken und klassischen physiologischen Studie hat gezeigt, dass Urin-Generation gezeigt, in die Fliege durch die Sekretion eines Kaliumchlorid-reiche Flüssigkeit aus dem Hauptsegment der Röhrchen erfolgt. erfolgt dies durch die parallele transepithelialen Sekretion von Kationen, in erster Linie ^K +, sondern auch ^Na +, durch die Hauptzelle und Cl ^-. Sekrets durch die Sternzellen ^8-12 Die Fähigkeit, transepithelialen ^K + und Na ⁺ Flüsse getrennt zu messen ermöglicht eine genauere Charakterisierung von Transportmechanismen als die Messung Flüssigkeitssekretion allein, z. B. in unstimulierten Drosophila Tubuli, die Na ^{+ / K +} -ATPase-Inhibitors Ouabain hat keine Auswirkung auf Flüssigkeitssekretion ^2, auch wenn ihre Aufnahme in den Hauptzellen wird durch den organischen Anionentransporter Inhibitor Taurocholat ¹³ gesperrt. Jedoch Linton und O'Donnell zeigte, dass Ouabain depolarisiertder basolateralen Membranpotential und erhöht ^Na + Fluss ^9. Wie in den Repräsentative Ergebnisse gezeigt, repliziert haben wir die Ergebnisse und zeigte, daß K ⁺ Flußmittel gleichzeitig ^um 14; die erhöhte ^Na + Fluss und verminderte ^K + Fluss haben entgegengesetzte Auswirkungen auf Flüssigkeitssekretion, was zu keiner Nettoänderung der Sekretion. So gibt es zwei Entschließungen zum "Ouabain Paradox", das heißt, die anfängliche Beobachtung, dass keine Auswirkung auf Flüssigkeitssekretion im Drosophila-Röhrchen Ouabain:. Zunächst in stimulierten Tubuli, ist nicht ersichtlich, die Wirkung von Ouabain auf Flüssigkeitssekretion aufgrund seine Aufnahme durch den organischen Anionentransporter ^13; und zweitens, in unstimulierten Tubuli, Ouabain hat gegenläufige Effekte auf transepithelialen ^Na + und K ⁺ Fluss, was zu keiner Nettoänderung der Flüssigkeitssekretion (siehe Repräsentative Ergebnisse und ref. 9). Die primäre Rolle der Na ^{+ / K +} -ATPase in unstimulierten Tubuli ist es, intrazellulären Na ^{+ -Konzentration} zu senken, um eine günstige Konzentrationsgradienten zu erzeugen für die ^Na + -gekoppelten Transportprozesse in der basolateralen Membran. Tat kann durch separates Messen Na ^{+ und} K ⁺ Flüsse zeigten wir, dass Tubuli fehlt die Fliege Natrium-Kalium-2-Chlorid-Cotransporter (NKCC) haben transepithelialen K ⁺ Flusses vermindert, wobei keine weitere Abnahme nach Ouabain hinaus und keine Veränderung des transepithelialen ^Na + Fluss ^14. Diese Ergebnisse unterstützten unsere Schlussfolgerung, dass ^Na + in die Zelle durch die NKCC wird durch die ^Na + ^/ K + -ATPase recycelt. In einem anderen Beispiel Ianowski et al. Beobachtet, dass die Senkung Bad K ^{+ -Konzentration} von 10 mM bis 6 mM verringert transepithelialen K ⁺ Flußmittel und erhöht den transepithelialen Na ⁺ Flusses in Tubuli aus Rhodnius prolixus, ohne Nettoänderung in Flüssigkeitssekretion <sup> 15. Unterschiedliche Auswirkungen auf ^Na + ^und K + Flussflusses über Larven Tubuli wurden auch in Drosophila Tubuli als Reaktion auf variierende Salzdiäten ^{16 und} in zwei Mückenarten in Reaktion auf die Aufzucht Salinität ¹⁷ beobachtet worden.

Die größte Herausforderung bei der Messung des transepithelialen Ionenfluß im Ramsay Probenaufbereitung ist die Bestimmung von Ionenkonzentrationen in der sekretierten Flüssigkeit. Diese Herausforderung hat mit unterschiedlichen Lösungen, einschließlich flamm photometery ^18, Verwendung von radioaktiven Ionen ^{19 und} Elektronensonde Wellenlänge Spektroskopie ²⁰ erfüllt sind. Diese Techniken erfordern Übertragung des sekretierten Fluidtropfen auf ein Instrument zur Messung von Ionenkonzentrationen. Da das Volumen der Flüssigkeit durch den unstimulierten Drosophila Tubulus sekretiert ist klein, typischerweise ~ 0,5 nl / min, stellt dies eine technische Herausforderung dar und führt auch Fehler, wenn einige der sekretierten Flüssigkeitverlor bei der Übertragung. Im Gegensatz dazu die Verwendung von ionenspezifischen Elektroden ermöglicht die Messung der Ionenaktivität (von dem Ionenkonzentration berechnet werden kann) in situ. Das aktuelle Protokoll wurde von dem von Maddrellschem und Kollegen zur transepithelialen K ⁺ Flusses über die Rhodnius Tubulus Messung mit Valinomycin als Ionophor K ^{+ 21} angepasst, und beschreibt auch die Verwendung eines 4-tert-Butylcalix [4] aren-tetraessigsäure Tetraethylester basierten ^Na + -spezifische ionenspezifischen Elektrode, gekennzeichnet durch Messerli et. al. ^22. Ionenspezifischen Elektroden wurden ebenfalls verwendet, um die Ionenkonzentrationen in Flüssigkeit durch Malpighischen im Ramsay Assay bei Erwachsenen ^9,23 und ¹⁶ Larven Drosophila melanogaster sezerniert zu messen, der Neuseeland-Alpine Weta (Hemideina maori) ^{24 und} in Moskitos ^17.

Hier beschreiben wir im Detail die Verwendung des so Ramsaysage Flüssigkeitssekretion Raten in Malpighischen von Drosophila melanogaster, sowie die Verwendung von ionenspezifischen Elektroden, die Konzentrationen von K ⁺ und Na ⁺ innerhalb von sekretierten Flüssigkeit zu bestimmen und somit die Berechnung der transepithelialen Ionenflüsse zu messen. Eine Übersicht des Tests ist in Figur 1 vorgesehen.

Abbildung 1. Schematische Darstellung des Vasa Malpighi und der Ramsay-Assay unter Verwendung von ionenspezifischen Elektroden, die an Ionenkonzentrationen zu messen. Diese Abbildung zeigt das Setup für die Ramsay Assay. (A) Jede Fliege hat vier Röhrchen, ein Paar von vorderen Tubuli und ein Paar von hinteren Tubuli, die schwimmen in der Bauchhöhle von Hämolymphe umgeben. In jedem Paar, verbinden die beiden Röhrchen in den Harnleiter, die dann leert den Urin an der Kreuzung des Mitteldarms und hindgut. Die Röhrchen sind blind digen. Urin wird durch die (in rot dargestellt) Flüssigkeit absondernden Hauptsegment erzeugt und strömt in Richtung des Harnleiters und hinaus in den Darm. Nach der Präparation wird die Tubuli Paar aus dem Darm durch Durchtrennung des Harnleiters dissoziiert. (B) Das Paar von Röhrchen wird dann in einen Tröpfchenbadesalzlösung innerhalb einer Vertiefung des Assays Schale überführt. Eines der beiden Röhrchen, hier als die "Anker Tubulus" ist um einen Metallstift gewickelt und ist inert. Die andere Röhrchen ist die sezernierenden Röhrchen. Das Anfangssegment (die nicht Flüssigkeit sezerniert) und Hauptsegment der sezernierenden Röhrchen bleiben innerhalb des Tröpfchens des Badens Kochsalzlösung. Ionen und Wasser Umzug von der Badekochsalzlösung und in die Tubuluslumen des Hauptsegments und dann in Richtung des Harnleiters zu bewegen, wie es in vivo auftreten. Das untere Segment (blau) ist außerhalb der Badesalzlösung und daher inert. Da der Harnleiter geschnitten wird, tritt der sekretierten Flüssigkeit als ein Tröpfchen von dem geschnittenen Ende des Ureters. Ter sezerniert Fluidtröpfchen vergrößert Laufe der Zeit als Sekret setzt, und sein Durchmesser wird unter Verwendung eines okularen Mikrometers gemessen. Eine Schicht von Mineralöl verhindert die Verdunstung des sekretierten Flüssigkeit. Die Referenz- und ionenspezifische Elektroden messen die Ionenkonzentration der Flüssigkeit ausgeschieden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protocol

1. Vorbereiten der Sezierung, Kalibrierung und Test Geschirr Hinweis: In diesem Schritt werden drei Kunststoff-Petrischalen mit Silikon-Elastomer ausgekleidet zubereitet: eine für die Präparation, eine für die Durchführung der Ramsay-Test ("Test Gericht"), und eine für die Kalibrierung. Diese Gerichte werden aus dem Experiment wiederverwendet, zu experimentieren, und so dieser Schritt muss nur dann, wenn ein Gericht Pausen wiederholt werden. Ein Bild des Assays Schale wird…

Representative Results

Die 7 und 8 zeigen, dass die Verwendung des Ramsay Assay mit ionenspezifischen Elektroden gegenüber K + und Na + -Konzentration zu messen, kann die genetische und pharmakologisch verschieden K + und Na + Flüsse, Informationen, die nicht durch die Messflüssigkeit Sekretionsraten allein erfasst wird unterscheiden. Fig 7 zeigt, dass Fluid-Sekretion in Tubuli von Fliegen, die eine homozygote Nullmutation in der NKCC verringert wird durch eine A…

Discussion

Die Verwendung des Ramsay Assay zusammen mit ionenspezifischen Elektroden, ermöglicht die Messung der Fluid Sekretionsraten und Ionenströme in isolierten Insekten Malpighian (Niereninsuffizienz) Tubuli. Zwanzig oder mehr Tubuli kann zu einem Zeitpunkt untersucht werden, was einen höheren Durchsatz im Vergleich zu dem Assay in vitro einzelne microperfused Tubuli. Zusätzlich ionenspezifischen Elektroden erlauben die Bestimmung von Ionenkonzentrationen in der sekretierten Flüssigkeit in situ, die Beg…

Materials

Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/	May be purchased from multiple distributors
Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Specific brand is not important
Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm	Corning Life Sciences	Fisher 08-757-100A	Specific brand is not important
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Specific brand is not important
Scalpel Blades #1	Fine Science Tools	10011-00	Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions
Needle, 30G x 1/2	Becton Dickinson	305106	Use appropriate sharps precautions
Minutien pins, black anodized, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800	Specific brand is not important; this is given as an example
Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick	Hobby shop		Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)
Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers)	Hobby shop		Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass
Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0042
Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0044
Nitric acid, 70%	Sigma	438073	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important
Cimarec 7 in x 7 in hotplate	Fisher	11675911Q	Specific brand is not important; caution when heated
Selectophore dichlorodimethylsilane	Sigma	40136-1ML	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Two-step vertical pipet puller	Narishige	PC-10	Other pipet pullers can be used; this is given as an example
Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height	Fisher	08-748E	Specific brand is not important; only one dish needed
World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar	Fisher	50-821-852	May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.
Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh	Fisher	S161-500	Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability
World Precision Instruments MicroFil, 34G	Fisher	50-821-914	May be available from other distributors.
1 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309659	May be available from other distributors.
3 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309657	May be available from other distributors.
D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard	Cole-Parmer	UX-30600-02	Specific brand is not important
Female Luer Locking Connector	4 Medical Solutions	ADC 9873-10	Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.
Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm)	Fisher	14-179-110	Specific brand is not important
E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in	Fisher	14171208	Specific brand is not important
Modeling clay			Specific brand is not important
Selectophore potassium ionophore I, cocktail B	Sigma	99373	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Selectophore sodium ionophore X	Sigma	71747	Sodium ionphore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester
Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether	Sigma	73732
Selectophore sodium tetraphenylborate	Sigma	72018
Schneider's Drosophila medium	Life Technologies	21720024
High impedance electrometer	World Precision Instruments	FD223a
Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle	Warner Instruments	64-1051
Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented	Warner Instruments	64-1007
Silver wire	Warner Instruments	64-1318
Micromanipulators, pair	Leitz		Various brands/models will work; this is an example
Faraday cage	Technical Manufacturing Corporation	81-334-03	This is an example; any Faraday cage will work
Single gooseneck fiberoptic light	Nikon		Specific brand is not important
mineral oil	Fisher	BP-2629	Specific brand is not important
forceps, Dumont #5 with Biologie tip	Fine Science Tool	11295-10	May be available from other distributors.