で液分泌とイオンフラックス速度を測定するためのラムゼイアッセイの使用<em>キイロショウジョウバエ</em>マルピーギ管

Summary

このプロトコルは、 キイロショウジョウバエから単離しマルピーギ（腎）細管からの流体分泌速度を測定するためのラムゼイアッセイの使用を記載しています。また、イオン特異的電極の使用は、経上皮イオンフラックスの計算を可能にする、分泌液中のナトリウム及びカリウムの濃度を測定するために、記載されています。

Abstract

腎上皮イオン輸送の調節は、生物が外部条件の変化の顔にイオン性および浸透圧の恒常性を維持することができます。 キイロショウジョウバエマルピーギ（腎臓）細管が原因でこの生物の強力な遺伝学と生理学的研究への尿細管のアクセスに、上皮のイオン輸送の分子メカニズムを研究するための比類のない機会を提供しています。ここで、我々は、分泌液中のナトリウム及びカリウムの濃度を測定するために、イオン特異的電極を使用して、単離されたフライ尿細管からの流体の分泌速度を測定するためラムゼイアッセイの使用を記載しています。このアッセイは、イオン濃度を測定するための別の装置に分泌液を転送する必要なく、一度に20〜細管の上皮の流体及びイオンフラックスの研究を可能にします。遺伝的に異なる細管は、輸送プロセスにおける特定の遺伝子の役割を評価するために分析することができます。また、Bathing生理食塩水を添加し、その化学的性質、または薬物またはホルモンの影響を調べるために改変することができます。要約すると、この技術は、基本的なショウジョウバエの細管上皮イオン輸送機構、ならびにこれらの輸送メカニズムの規制の分子特徴づけを可能にします。

Introduction

腎上皮イオン輸送は、生物のiono-と浸透圧調節の下にあります。 キイロショウジョウバエマルピーギ（腎臓）細管上皮イオン輸送の分子メカニズムを研究するための比類のない機会を提供しています。これは、生理的な研究への尿細管のアクセスとペアにショウジョウバエの強力な遺伝学の組み合わせに起因するものです。技術^{1を開拓し} 、研究者の名にちなんで名付けラムゼイアッセイは、孤立したマルピーギ細管から流体分泌速度を測定し、ダウと同僚^2で 1994年にショウジョウバエに設立されました。これは、流体の分泌を調節する細胞特異的なシグナル伝達経路を定義するには、そのようなGAL4-UASシステム^3,4 ショウジョウバエ遺伝的ツールを使用して、さらなる研究のために道を開きました。例は、他の多くの中で^6,7-ペプチドホルモン⁵に対する応答におけるカルシウムシグナル伝達を含みます。

ハエは、尿細管の主なセグメントからの塩化カリウムに富む流体の分泌を介して起こるでve_content ">遺伝子技術と古典的な生理学的研究の組み合わせは、その尿の生成を示している。これは主に、陽イオンの並列経上皮分泌を介して行われKは⁺だけでなく、 ^の Na + ^は 、主細胞、およびClを通して^{– 。}星細胞^8-12を通じて分泌別途経上皮^の K +およびNa ⁺フラックスを測定する能力は、流体分泌の測定よりも輸送メカニズムのより詳細な特性評価を可能にします単独で、例えば、非刺激ショウジョウバエ細管ではNa ⁺ / K ⁺ -ATPアーゼ阻害剤ウアバインは、主細胞への取り込みは、有機アニオントランスポーター阻害剤タウロコール酸¹³によって阻害された場合でも、体液分泌²には影響を与えないが、リントンとオドネルは、ウアバインが脱分極することを示しました側底膜電位、およびNa ^{+フラックス9を上昇させます} 。代表的な結果に示すように、我々はこれらの結果をレプリケートし、K ⁺フラックス^14を同時に減少させることが示されました。増加^の Na + ^{フラックスおよび} K +フラックスを減少させた分泌の正味の変化が生じ、流体分泌に対する反対の効果を持っています。 。このように、「ウアバインパラドックス」、すなわちへの2つの解像度があり、 ショウジョウバエの細管内の流体の分泌に影響を与えませんウアバイン初期観察は：まず、刺激細管に、流体分泌に対するウアバインの効果は明らかではないが原因有機アニオントランスポーター¹³によるその取り込み。そして第二に、非刺激細管に、ウアバインは（代表的な結果とrefを参照してください。9）液分泌の純変化なしで、その結果、上皮^の Na + ^および K +フラックスへの影響に反対しています。 Na + / ^K + -ATPのため、主な役割非刺激細管にアーゼ基底膜を越えて輸送プロセスを共役型のNa ⁺のための有利な濃度勾配を生成するために、細胞内のNa ^+濃度を低下させることです。確かに、別々 ^の Na + ^および K +フラックスを測定することにより、我々は、フライナトリウム-カリウム-2-塩化共輸送体（NKCC）を欠いている細管をさらにウアバイン添加後減少し、経上皮に変化がないがないと、経上皮K ⁺フラックスが低下していることを実証しましたNa ^{+が14フラックス} 。これらの知見は、NKCCを通じてセルに入る^の Na + ^{をNa +} / ^K + -ATPアーゼを介してリサイクルされ、私たちの結論を支持しました。別の例では、Ianowski ら 6mmの10 mMのからバス^K +濃度の低下は、流体分泌の純変化なしで、経上皮K ⁺フラックスとRhodniusのprolixusから尿細管における増加した上皮^の Na + ^流入を減少することが観察され<sup> 15。幼虫細管全体で^の Na + ^{フラックスおよび} K +フラックスの差動効果も塩分^17を飼育することに応答して変動する塩食¹⁶に二蚊の種に応じて、 ショウジョウバエの細管において観察されています。

ラムゼイアッセイ調製物における経上皮イオンフラックスの測定における最大の課題は、分泌された流体内のイオン濃度の決意です。この課題は、難photometery ^18、放射性イオン¹⁹を使用すると、電子プローブ波長分散分光法²⁰を含む様々なソリューションと満たされています。これらの技術は、イオン濃度を測定するための機器に分泌液滴の移動を必要とします。非刺激ショウジョウバエ細管により分泌される流体の体積が小さいため、通常は0.5〜NL /分で、これは技術的な課題を提起し、分泌された流体の一部である場合、エラーが導入され転送時に失わ。対照的に、イオン特異的電極の使用は、 その場での （イオン濃度を算出することが可能な）イオン活性の測定を可能にします。現在のプロトコルは^、K +イオノフォア²¹としてバリノマイシン使用してRhodnius細管全体の経上皮K ⁺フラックスを測定するためにMaddrellらによって使用されるものから適合し、また、4- ターシャの -butylcalix [4]アレーン四酢酸の使用が記載されましたテトラエチルエステル系NaがMesserli らによって特徴づけられる特異的イオン固有の電極を^+。アル^。22。イオン特定電極はまた、大人の^9,23および幼虫¹⁶ キイロショウジョウバエでラムゼイアッセイにおいてマルピーギ細管により分泌液中のイオン濃度を測定するために使用されてきた、ニュージーランドアルパインウェタ（Hemideinaマオリ ^）24と蚊^17インチ

ここでは、詳細にラムゼイとしての使用を記載ショウジョウバエからマルピーギ細管流体分泌速度を測定するだけでなく、分泌液、したがって、経上皮イオンフラックスの計算内^の K +およびNa ⁺の濃度を決定するために、イオン固有の電極を使用すると言います。アッセイの概要を図1に提供されます。

マルピーギ細管の図1の回路図とイオン濃度を測定するためのイオン特定電極の使用とラムゼイアッセイ 。この図は、ラムゼイアッセイのためのセットアップを示しています。 （A）各フライは、4つの細管、前方細管一対の後部細管のペア、血リンパに囲まれた腹腔内のそのフロートを持っています。各ペアでは、二つの細管はその後、中腸とhindguの接合部に尿を空に尿管、に参加しますトン。細管は、ブラインド・エンドです。尿は（赤で示した）は、流体分泌メインセグメントによって生成され、消化管に尿管に向かって内外に流れます。解剖後、細管のペアは、尿管を横断することにより、腸から解離します。 （B）は、尿細管のペアは、その後、アッセイ皿のウェル内入浴食塩水の液滴に移しました。 2細管の一つは、「アンカー細管は、「金属ピンの周りを包み、不活性であるとしてここでいいます。他の細管は、分泌細管です。 （液体を分泌しない）最初のセグメントと分泌細管の主なセグメントは、入浴の生理食塩水の液滴内に残ります。その後、イオンと水の移動入浴生理食塩水から、主要セグメントの尿細管内腔へ、および生体内で起こるように、尿管に向かって移動します。下部セグメント（青）が入浴生理食塩水、したがって不活性外です。尿管が切断されるので、分泌液が尿管の切断端からの液滴として現れます。 T彼は、分泌が続くように、流体液滴が時間とともに拡大し、分泌され、その直径は、接眼マイクロメータを用いて測定されます。ミネラルオイルの層は、分泌液の蒸発を防止します。リファレンスとイオン特定電極が分泌液のイオン濃度を測定する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Protocol

1.準備解剖、キャリブレーションおよびアッセイ料理注：このステップでは、シリコーンエラストマーと並ぶ3プラスチック製のペトリ皿を調製する：解剖のための1つ、ラムゼイアッセイを行うための1つの（「アッセイ皿」）、およびキャリブレーションを実行するための1。これらの料理は実験する実験から再利用され、したがって、このステップは唯一の皿が破損?…

Representative Results

図7、図8、K +およびNa +濃度を測定するために、イオン特定電極とラムゼイアッセイの使用を示す遺伝的および薬理学的に異なるK +およびNa +フラックス 、単独の流体分泌速度を測定することにより、捕捉されない情報を区別することができます。 図 Na +フラックスが（ 図7B）に変更されていない間NKCCにおけるホ?…

Discussion

一緒にイオン固有の電極を有するラムゼイアッセイの使用は、孤立した昆虫マルピーギ（腎）細管内の流体分泌速度とイオンフラックスの測定を可能にします。 20以上の細管は 、インビトロmicroperfused細管内の個々のアッセイと比較してより高いスループットを可能にする、一度にアッセイすることができます。また、イオン特異電極は、第2の装置への流体の少量の移動に導入?…

Materials

Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/	May be purchased from multiple distributors
Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Specific brand is not important
Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm	Corning Life Sciences	Fisher 08-757-100A	Specific brand is not important
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Specific brand is not important
Scalpel Blades #1	Fine Science Tools	10011-00	Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions
Needle, 30G x 1/2	Becton Dickinson	305106	Use appropriate sharps precautions
Minutien pins, black anodized, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800	Specific brand is not important; this is given as an example
Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick	Hobby shop		Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)
Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers)	Hobby shop		Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass
Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0042
Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0044
Nitric acid, 70%	Sigma	438073	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important
Cimarec 7 in x 7 in hotplate	Fisher	11675911Q	Specific brand is not important; caution when heated
Selectophore dichlorodimethylsilane	Sigma	40136-1ML	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Two-step vertical pipet puller	Narishige	PC-10	Other pipet pullers can be used; this is given as an example
Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height	Fisher	08-748E	Specific brand is not important; only one dish needed
World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar	Fisher	50-821-852	May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.
Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh	Fisher	S161-500	Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability
World Precision Instruments MicroFil, 34G	Fisher	50-821-914	May be available from other distributors.
1 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309659	May be available from other distributors.
3 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309657	May be available from other distributors.
D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard	Cole-Parmer	UX-30600-02	Specific brand is not important
Female Luer Locking Connector	4 Medical Solutions	ADC 9873-10	Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.
Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm)	Fisher	14-179-110	Specific brand is not important
E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in	Fisher	14171208	Specific brand is not important
Modeling clay			Specific brand is not important
Selectophore potassium ionophore I, cocktail B	Sigma	99373	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Selectophore sodium ionophore X	Sigma	71747	Sodium ionphore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester
Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether	Sigma	73732
Selectophore sodium tetraphenylborate	Sigma	72018
Schneider's Drosophila medium	Life Technologies	21720024
High impedance electrometer	World Precision Instruments	FD223a
Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle	Warner Instruments	64-1051
Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented	Warner Instruments	64-1007
Silver wire	Warner Instruments	64-1318
Micromanipulators, pair	Leitz		Various brands/models will work; this is an example
Faraday cage	Technical Manufacturing Corporation	81-334-03	This is an example; any Faraday cage will work
Single gooseneck fiberoptic light	Nikon		Specific brand is not important
mineral oil	Fisher	BP-2629	Specific brand is not important
forceps, Dumont #5 with Biologie tip	Fine Science Tool	11295-10	May be available from other distributors.