Использование Рамсей анализе измерить жидкости секреции и поток ионов ставки в<em> Дрозофилы</em> Мальпигиев канальцев

Summary

Этот протокол описывает использование анализа Ramsay для измерения скорости жидкости секреции изолированных мальпигиев (почечная) канальцев из дрозофилы. Кроме того, использование ион-специфических электродов для измерения концентрации натрия и калия в секретируемого жидкости, что позволяет рассчитать потока ионов трансэпителиальная, описан.

Abstract

Модуляция почечной транспорта ионов эпителиальной позволяет организмы для поддержания ионной и осмотическое гомеостаз в условиях различной внешних условий. Дрозофилы мальпигиев (почечная) трубочка предлагает уникальную возможность для изучения молекулярных механизмов транспорта ионов эпителия, из-за мощных генетики этого организма и доступности ее почечных канальцах физиологического исследования. Здесь мы описываем использование анализа Ramsay для измерения скорости жидкости секреции изолированные мух почечных канальцев, с использованием ион-специфических электродов для измерения концентрации натрия и калия в секретируемого жидкости. Этот анализ позволяет изучение трансэпителиальная жидкости и ионных потоков ~ 20 трубочек в то время, без необходимости переноса секретируемый жидкости в отдельном устройстве для измерения концентрации ионов. Генетически различные трубочки могут быть проанализированы, чтобы оценить роль специфических генов в процессах переноса. Кроме того, бathing солевой могут быть изменены с целью изучения воздействия своих химических характеристик, или наркотиков или гормонов добавил. Таким образом, эта методика позволяет молекулярной характеристики основных механизмов транспорта ионов в эпителиальной канальца Drosophila, а также регулирование этих транспортных механизмов.

Introduction

Почечная транспорт эпителиальных ионов лежит в основе организменном ионосферы и осморегуляции. Дрозофилы мальпигиев (почечная) трубочка предлагает уникальную возможность для изучения молекулярных механизмов транспорта ионов эпителия. Это связано с комбинацией мощных генетики дрозофилы, в паре с доступностью его почечных канальцев к физиологическому изучению. Рамсей анализ, названный в честь исследователя, который впервые технику ^1, измеряет жидкость цены секреции из изолированных мальпигиевых канальцев, и была создана в 1994 году дрозофилы в Доу и коллег ^2. Это проложило путь для дальнейших исследований с использованием генетических Drosophila инструменты, такие как системы GAL4-UAS ^3,4, чтобы определить соты сигнальные пути, регулирующие секрецию жидкости. Пример включает в себя сигнализацию кальция в ответ на это пептидный гормон, ⁵ среди многих других ^6,7.

ve_content "> Сочетание генетических методов и классического физиологического исследования показали, что поколение мочи в лету происходит через секреции хлорида богатых жидкости калия из основного сегмента канальцев. Это происходит через трансэпителиального секреции параллельно катионов, прежде всего, ^К +, но и ^Na +, через основной камере, и ^Cl -. секреции через звездчатого клетки ^8-12 Способность отдельно измерить трансэпителиальная потоков ^К + и ^Na + позволяет более подробную характеристику транспортных механизмов, чем измерение секреции жидкости в покое. Например, в нестимулированных канальцев Drosophila, ^Nа + / ^К + -АТФазы ингибитор оуабаин не имеет никакого эффекта на секрецию ² жидкости, даже когда его поглощение в основных клетках ингибируется органический анион транспортер ингибитора таурохолата ^13. Тем не менее, Линтон и О'Доннелл показал, что уабаин деполяризуетбазолатеральный мембранный потенциал, и увеличивает поток ^Na + ^9. Как показано в представительных результатов, мы воспроизвели эти результаты и показали, что поток ^К + одновременно снизился ^14; увеличение потока Na ⁺ и ^K + снизился поток имеет противоположные эффекты на секрецию жидкости, в результате чего не чистого изменения в секреции. Таким образом, есть две резолюции к "уабаина парадокса", т.е., начальное наблюдение, что уабаина не имеет никакого эффекта на секрецию жидкости в канальцах Drosophila:. Во-первых, в стимулированных канальцев, эффект уабаина на секрецию жидкости не является очевидным из-за его поглощение в органический анион транспортер ^13; во-вторых, в нестимулированных канальцев, оуабаин имеет противоположные эффекты на трансэпителиальная ^Na + ^и К + потока, что приводит к отсутствию изменений в чистой секреции жидкости (см Представитель Результаты и Ref. 9). Таким образом, основная роль Na ⁺ / ^K + -АТФазы в стимулированных канальцев снизить концентрацию внутриклеточного ^Na + для создания благоприятного градиента концентрации для ^Na +, -coupled транспортных процессов по базолатеральной мембране. Действительно, отдельно измерения Na ^{+ и K} + потоки, мы показали, что канальцы не хватает на лету натрия калия-2-хлорида котранспортера (NKCC) снизились трансэпителиальный ^K + поток, без дальнейшего снижения после уабаина того, и никаких изменений в трансэпителиального ^Na +, поток ^14. Эти данные поддержал наш вывод, что ^Na +, введя ячейку через NKCC возвращают через Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы. В другом примере, Ianowski и др. Наблюдали, что снижение ванны ^{концентрации} К + от 10 мм до 6 мм уменьшилось трансэпителиальный ^K + поток и увеличение трансэпителиальный ^Na +, в канальцах поток от Rhodnius prolixus, без чистого изменения в секреции жидкости <sup> 15. Дифференциальные воздействие на поток и K ^{+ Na} + поток через личиночной канальцев наблюдали также в Drosophila канальцев в ответ на разной соли диеты ^{16 и} в двух видов комаров в ответ на выращивании соленость ^17.

Самой большой проблемой в измерении потока ионов трансэпителиальная в подготовке Рамсей анализа является определение концентраций ионов внутри секретируется жидкости. Эта задача была выполнена с различной решений, в том числе фотометрию пламени ^18, применение радиоактивных ионов ^19, и волны зонда электронного дисперсионные спектроскопии ^20. Эти методы требуют передачи секретируемого капли жидкости на прибор для измерения концентрации ионов. Поскольку объем жидкости, секретируемый нестимулированных Drosophila трубочку мала, обычно ~ 0,5 нл / мин, это создает техническую проблему, а также вносит ошибку, если некоторые из секретируемого жидкостипотеряли при передаче. В противоположность этому, использование ион-специфических электродов позволяет измерять активности ионов (из которой концентрация ионов может быть рассчитано) на месте. Текущий протокол был адаптирован от используемого Maddrell и коллегами для измерения трансэпителиальный ^K + поток через трубочку Rhodnius в использовании валиномицина как ^K + ионофор ^21, а также описывает использование 4-трет–butylcalix [4] арена-этилендиаминтетрауксусной кислоты тетраэтилсвинец на основе сложного эфира ^Na + Определённые ионный конкретных электрод характеризуется Messerli др. др. ^22. Ион-специфичные электроды были также использованы для измерения концентрации ионов в жидкости, выделяемой мальпигиевых канальцев в анализе Рамсей во взрослой ^9,23 и личинок дрозофилы ^16, Новой Зеландии Горные Weta (Hemideina маори) ^{24 и} в ¹⁷ комаров.

Здесь мы подробно использование Рамсей какговорят, чтобы измерить жидкости цены секреции в канальцах мальпигиевых из дрозофилы, а также использование ион-специфических электродов для определения концентрации K ^{+ и} Na ⁺ в секретируемого жидкости и, таким образом расчет трансэпителиальная ионных потоков. Обзор анализа обеспечивается на фиг.1.

Рисунок 1. Схема мальпигиевых и Рамсей Анализ с использованием ион-специфических электродов измерить концентрации ионов. Эта цифра показывает установку для анализа Рамсей. (А) Каждый муха имеет четыре трубочки, пару передних канальцев и пару задних канальцев, которые плавают в брюшной полости, окруженной гемолимфы. В каждой паре, две трубочки соединяются в мочеточнике, который затем впадает мочи на стыке кишки и hindguт. Трубки слепы состава. Моча образуется в жидкости, секретирующие основной сегмент (показан красным), и течет к мочеточника и вышел в кишечнике. После вскрытия, пара трубочка диссоциирует из кишечника по пересекающих мочеточник. (B) пара канальцев затем переносили в капле физиологического раствора купания в лунку анализа блюдо. Один из двух трубочек, называют здесь как "якоря трубочку," обернут вокруг металлический штырь и инертен. Другой трубочка является секрецию канальцев. Начальный участок (который не секретирует жидкость) и основной сегмент, секретирующих трубочку оставаться в капле физиологического раствора купания. Ионы и вода переход от купания и солевом растворе в просвете канальцев основной сегмент, а затем перейти к мочеточника, как это происходит в естественных условиях. Нижний сегмент (синий) находится за пределами купания физиологического раствора, и поэтому инертны. Поскольку мочеточник вырезать, секретируемый жидкости возникает как капли от срез мочеточника. ТОн секретируется капель жидкости увеличивает течением времени, как секреции продолжается, и его диаметр измеряется с помощью окулярного микрометра. Слой минерального масла предотвращает испарение жидкости секретируемого. Конкретные ссылки и ионов электроды измерения концентрации ионов секретируемого жидкости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

1. Подготовка рассечение, калибровка и Пробирной Блюда Примечание: На этом этапе, три пластиковые чашки Петри выложены силиконового эластомера получают: один для вскрытия, один для выполнения Ramsay анализа ("Анализ блюдо"), и один для проведения калибровки. Эти блюда…

Representative Results

7 и 8 показывают, что применение анализа Ramsay с ион-специфических электродов для измерения концентрации К + и Na + можно выделить генетически и фармакологически отличный K + и флюсы Na +, информацию, которая не захвачен измерения плавные частоты секреции в пок?…

Discussion

Применение анализа Ramsay вместе с ион-специфических электродов, позволяет измерять жидкости ставок секреции и ионных потоков в изолированных насекомых мальпигиевых (почечных канальцев). Двадцать и более канальцы могут быть проанализированы в то время, позволяя более высокую пропускну?…

Materials

Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/	May be purchased from multiple distributors
Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Specific brand is not important
Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm	Corning Life Sciences	Fisher 08-757-100A	Specific brand is not important
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Specific brand is not important
Scalpel Blades #1	Fine Science Tools	10011-00	Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions
Needle, 30G x 1/2	Becton Dickinson	305106	Use appropriate sharps precautions
Minutien pins, black anodized, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800	Specific brand is not important; this is given as an example
Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick	Hobby shop		Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)
Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers)	Hobby shop		Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass
Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0042
Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0044
Nitric acid, 70%	Sigma	438073	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important
Cimarec 7 in x 7 in hotplate	Fisher	11675911Q	Specific brand is not important; caution when heated
Selectophore dichlorodimethylsilane	Sigma	40136-1ML	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Two-step vertical pipet puller	Narishige	PC-10	Other pipet pullers can be used; this is given as an example
Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height	Fisher	08-748E	Specific brand is not important; only one dish needed
World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar	Fisher	50-821-852	May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.
Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh	Fisher	S161-500	Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability
World Precision Instruments MicroFil, 34G	Fisher	50-821-914	May be available from other distributors.
1 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309659	May be available from other distributors.
3 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309657	May be available from other distributors.
D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard	Cole-Parmer	UX-30600-02	Specific brand is not important
Female Luer Locking Connector	4 Medical Solutions	ADC 9873-10	Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.
Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm)	Fisher	14-179-110	Specific brand is not important
E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in	Fisher	14171208	Specific brand is not important
Modeling clay			Specific brand is not important
Selectophore potassium ionophore I, cocktail B	Sigma	99373	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Selectophore sodium ionophore X	Sigma	71747	Sodium ionphore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester
Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether	Sigma	73732
Selectophore sodium tetraphenylborate	Sigma	72018
Schneider's Drosophila medium	Life Technologies	21720024
High impedance electrometer	World Precision Instruments	FD223a
Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle	Warner Instruments	64-1051
Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented	Warner Instruments	64-1007
Silver wire	Warner Instruments	64-1318
Micromanipulators, pair	Leitz		Various brands/models will work; this is an example
Faraday cage	Technical Manufacturing Corporation	81-334-03	This is an example; any Faraday cage will work
Single gooseneck fiberoptic light	Nikon		Specific brand is not important
mineral oil	Fisher	BP-2629	Specific brand is not important
forceps, Dumont #5 with Biologie tip	Fine Science Tool	11295-10	May be available from other distributors.