Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening
Summary
Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.
Abstract
We hebben een screeningsplatform dedicated humane eiwitkinasen gefosforyleerd identificeren substraten die kunnen worden gebruikt om nieuwe signaaltransductieroutes ophelderen ontwikkeld. Onze aanpak biedt het gebruik van een bibliotheek van gezuiverde GST-gelabeld humaan proteïne kinasen en een recombinant eiwit substraat plaats. We hebben gebruik gemaakt van deze technologie MAP / microtubule-affiniteit regulerende kinase 2 (MARK2) identificeren als de kinase voor glucose gereguleerde plaats op CREB Regulated Transciptie coactivator 2 (CRTC2), een eiwit dat nodig is voor betaceldeling, alsmede de Axl familie van tyrosinekinasen als regulatoren van cel metastase door fosforylering van de adapter eiwit ELMO. We beschrijven deze technologie en te bespreken hoe het kan helpen om een uitgebreide kaart van hoe cellen reageren op prikkels uit de omgeving vast te stellen.
Introduction
Protein post-translationele modificaties (PTMs) zijn essentieel voor intracellulaire communicatie. Misschien is het beste bestudeerd van PTMs is fosforylering gekatalyseerd door proteïne kinases, die een groot aantal eiwit functies, waaronder hun biochemische activiteit, subcellulaire lokalisatie, conformatie, stabiliteit en reguleren. De identificatie van fosforyleringsplaatsen op doeleiwitten kan door tryptische fosfopeptidekartering of nu standaard proteomische technieken waarbij monsters verrijkt gefosforyleerde peptides 1,2. Terwijl driekwart van het tot expressie proteoom verwachting worden gefosforyleerd 3 en een geïdentificeerde 200.000 fosforyleringslocaties 5, met schattingen tot 1 miljoen 6, veel van deze geen toegewezen biologie, signaalweg of proteïne kinase.
Terwijl de identificatie van gefosforyleerd sites is relatief eenvoudig, een relatief grotere uitdaging is omidentificeren van de verwante kinase (s) die deze plaatsen gericht een werkwijze we noemen mapping kinase: substraat paren. Verschillende benaderingen voor het identificeren van kinase: substraat paren zijn beschreven, beginnend met een kinase van belang zijn en op zoek naar de substraten of het starten met een substraat van belang en een poging om een modificerend kinase experimenteel 11/07 of computationeel 12 te vinden. Om kinases een bekende gefosforyleerd substraat identificeren, kan bioinformatica worden gebruikt om eiwitten die een korte geconserveerde sequentie van aminozuren aan weerszijden van de gefosforyleerde residu (de consensus plaatse), alsook het identificeren van kinasen die een bezinkbare complex met het substraat bevat te identificeren. Echter, deze methoden zijn tijdrovend en vaak niet met succes bekroond.
We ontwikkelden een systematische functionele benadering om snel kinasen die een bepaald substraat 13 kan fosforyleren identificeren. Het scherm test produceert uitstekende specifieketeit, met een zeer duidelijke keuze voor potentiële verwante kinases. Gezien de centrale plaats van fosforylering biologische signalering, het scherm is nuttig voor ontdekking in nagenoeg alle cellen signaalroutes 14-16. Het scherm omvat het uitvoeren van een grootschalig kinase assay met een bibliotheek van menselijk eiwit kinasen. De kinasen zijn gelabeld met bacteriële glutathion S-transferase (GST) eiwit worden gezuiverd uit zoogdiercellen celextracten, hetgeen betekent dat de recombinante enzymen – anders dan die bereid uit bacteriën – gegenereerd in aanwezigheid van het stroomopwaartse eiwit kinasen vaak nodig voor het recombinante enzymen activiteit in vitro. Inderdaad, terwijl serine, threonine en tyrosine kinase-activiteit vereist voor downstream kinase activatie aanwezig in gist 10 zijn, de gist genoom codeert 122 proteïnekinasen, wat aangeeft dat het zoogdier kinome, meer dan 500 genen 17 is geworden aanzienlijk complexer om regulaTÉ de processen die uniek zijn voor hogere orde organismen. Bovendien kan het effect van verschillende stimuli voor celbiologie en menselijke ziekten (bijvoorbeeld kleine moleculen, groeifactoren, hormonen, enz.) Worden gebruikt om relevante 14,15 moduleren kinaseactiviteit in een geschikte omgeving.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aangezien de oorspronkelijke publicaties waarin de benadering 14,15, is de oorspronkelijke bibliotheek van 180 GST-kinases uitgebreid met 420 leden, en ~ 80% van het humane eiwit kinome. Met de uitgebreide bibliotheek, het protocol zoals beschreven duurt 4-5 dagen en dan 1-4 dagen om films te ontwikkelen (als noodzakelijk geacht), die door het gebruik van fosforimaging en digitale verhoging signaal kon worden ingekort. Er zijn een aantal belangrijke stappen waarbij zorg moet worden genomen (zie figuur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NSERC subsidie 386634. Wij willen de leden van de Screaton Lab bedanken voor nuttig discussies.
Materials
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 uL) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 uL) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 mL) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2X SDS lysis buffer (100 mL) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
- Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS chem. 10, 63-71 (2015).
- Sharma, K., et al. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation–a 25 year update. Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).
- Walsh, C. T. . Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature’s Inventory. , (2006).
- Boersema, P. J., et al. In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling. Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).
- Hutti, J. E., et al. A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity. Nat Methods. 1, 27-29 (2004).
- Johnson, S. A., Hunter, T. Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nat Methods. 2, 17-25 (2005).
- Pawson, T., Nash, P. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300, 445-452 (2003).
- Zhu, H., et al. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet. 26, 283-289 (2000).
- Shah, K., Shokat, K. M. A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases. Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).
- Zou, L., et al. PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites. BMC bioinform. 14, 247 (2013).
- Varjosalo, M., et al. Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling. Cell. 133, 537-548 (2008).
- Jansson, D., et al. Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).
- Fu, A., Screaton, R. A. Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family. Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).
- Abu-Thuraia, A., et al. Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion. Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
