Identification de paires Kinase-substrat en utilisant criblage à haut débit
Summary
Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.
Abstract
Nous avons développé une plate-forme de criblage pour identifier kinases dédiés de protéines humaines pour les substrats phosphorylés qui peuvent être utilisés pour élucider de nouvelles voies de transduction du signal. Notre approche comprend l'utilisation d'une bibliothèque de protéines kinases humaine étiquetée GST purifiées et un substrat de protéine recombinante d'intérêt. Nous avons utilisé cette technologie pour identifier MAP / microtubules affinité de régulation de la kinase 2 (MARK2) en tant que kinase pour un site de glucose régulé sur CREB-réglementées transcription coactivateur 2 (CRTC2), une protéine nécessaire pour la prolifération des cellules bêta, ainsi que la famille de tyrosine kinases de Axl tant que régulateurs de la métastase des cellules de la phosphorylation de la protéine adaptatrice rétroprojecteur. Nous décrivons cette technologie et nous discutons comment elle peut aider à établir une carte complète de la façon dont les cellules répondent aux stimuli environnementaux.
Introduction
Modifications post-traductionnelles de protéines (PTM) sont essentiels pour la communication intracellulaire. Peut-être le mieux étudié de PTM est tout phosphorylation, catalysée par la protéine-kinases, qui régulent une multitude de fonctions de protéines, y compris leur activité biochimique, la localisation subcellulaire, la conformation et la stabilité. L'identification des sites de phosphorylation sur des protéines cibles peut être accomplie par la cartographie trypsique phosphopeptide ou par des techniques protéomiques maintenant standard en utilisant des échantillons enrichis pour des peptides phosphorylés 1,2. Alors que les trois quarts du protéome exprimé devraient être phosphorylée 3 et un identifiées 200.000 sites de phosphorylation 5, avec des estimations allant jusqu'à 1 million 6, beaucoup d'entre eux ont pas attribué la biologie, voie, ou la protéine kinase de signalisation.
Bien que l'identification des sites phosphorylés est relativement simple, comparativement plus grand défi est deidentifier la kinase apparenté (s) qui cible ces sites, un processus que nous appelons cartographie kinase: paires de substrat. Plusieurs approches pour l'identification kinase: paires de substrats ont été décrits, que ce soit à partir d'une kinase d'intérêt et à la recherche de ses substrats ou à partir d'un substrat d'intérêt et d'essayer de trouver une modification kinase expérimentalement ou par calcul 12 11.7. Pour identifier les kinases pour un substrat phosphorylé connu, la bioinformatique peuvent être utilisés pour identifier des protéines qui contiennent une séquence conservée courte d'acides aminés flanquant le résidu phosphorylé (le site de consensus), ainsi que l'identification des kinases qui forment un complexe précipitable avec le substrat. Cependant, ces approches sont longues et souvent ne répondent pas avec succès.
Nous avons développé une approche fonctionnelle systématique pour identifier rapidement les kinases qui peut phosphoryler un substrat donné 13. Le test de l'écran produit une excellente spécifiquelité, avec une sélection très clair pour les kinases apparentées potentiels. Compte tenu de la centralité de la phosphorylation de la signalisation biologique, l'écran est utile pour la découverte dans la quasi-totalité des voies de signalisation cellulaires 14-16. L'écran consiste à effectuer une analyse de kinase à grande échelle avec une bibliothèque de protéines kinases humaines. Les kinases ont été marqués avec du glutathion bactérienne S-transférase (GST) et sont purifiés à partir d'extraits de cellules de mammifères, ce qui signifie que les enzymes recombinantes – à la différence de ceux qui sont préparés à partir de bactéries – sont générés en présence des protéines kinases en amont souvent requises pour la enzymes recombinantes ayant une activité in vitro. En effet, alors que l'activité de kinase de sérine, de la thréonine, et la tyrosine requise pour l'activation de la kinase en aval sont présents dans la levure 10, le génome de la levure codant pour 122 protéines kinases, ce qui indique que la kinome mammifère, plus de 500 gènes 17, est devenue nettement plus complexe dans le but de RegulaTe les processus uniques pour les organismes d'ordre supérieur. De plus, l'effet de différents stimuli pertinents pour la biologie cellulaire et la maladie humaine (tels que des petites molécules, facteurs de croissance, des hormones, etc.) peut être utilisé pour l'activité de kinase de 14,15 moduler dans un contexte approprié.
Protocol
Representative Results
Discussion
Depuis les publications originales décrivant l'approche 14,15, la bibliothèque originale de 180 TPS-kinases a été élargi à 420 membres, soit environ 80% de la kinome protéine humaine. Avec la bibliothèque élargi, le protocole comme décrit prend 4-5 jours, puis 1-4 jours pour développer des films (le juge nécessaire), qui pourrait être raccourcie par l'utilisation de phosphorimaging et l'amélioration de signal numérique. Il ya plusieurs étapes clés où les soins doivent être prise…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du CRSNG 386634. Nous tenons à remercier les membres du Screaton Lab pour des discussions utiles.
Materials
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 uL) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 uL) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 mL) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2X SDS lysis buffer (100 mL) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
- Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS chem. 10, 63-71 (2015).
- Sharma, K., et al. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation–a 25 year update. Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).
- Walsh, C. T. . Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature’s Inventory. , (2006).
- Boersema, P. J., et al. In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling. Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).
- Hutti, J. E., et al. A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity. Nat Methods. 1, 27-29 (2004).
- Johnson, S. A., Hunter, T. Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nat Methods. 2, 17-25 (2005).
- Pawson, T., Nash, P. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300, 445-452 (2003).
- Zhu, H., et al. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet. 26, 283-289 (2000).
- Shah, K., Shokat, K. M. A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases. Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).
- Zou, L., et al. PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites. BMC bioinform. 14, 247 (2013).
- Varjosalo, M., et al. Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling. Cell. 133, 537-548 (2008).
- Jansson, D., et al. Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).
- Fu, A., Screaton, R. A. Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family. Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).
- Abu-Thuraia, A., et al. Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion. Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
