Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening
Summary
Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.
Abstract
Wir haben ein Screening-Plattform zu dedizierten menschliche Proteinkinasen phosphoryliert für Substrate, die verwendet werden können, um neue Signaltransduktionswege aufzuklären identifizieren. Unsere Vorgehensweise bietet die Verwendung einer Bibliothek von gereinigtem GST-markiertes humanes Protein-Kinasen und ein rekombinantes Protein Substrat von Interesse. Wir haben diese Technologie ein Protein für die Beta-Zellproliferation erforderlich ist, sowie die verwendet werden, um MAP / Mikrotubuli-Affinität regulierenden Kinase 2 (Modell 2) als Kinase für eine Glucose-regulierten Website auf CREB-Regulated Transcriptional Koaktivator 2 (CRTC2) zu identifizieren, Axl Familie von Tyrosinkinasen als Regulatoren der Zellmetastasen durch Phosphorylierung des Adapterprotein ELMO. Wir beschreiben diese Technologie und diskutieren, wie sie helfen können, eine umfassende Karte, wie Zellen auf Reize aus der Umwelt zu etablieren.
Introduction
Protein posttranslationale Modifikationen (PTMs) essentiell für die intrazelluläre Kommunikation. Vielleicht ist die am besten untersuchten aller PTMs ist Phosphorylierung durch Proteinkinasen, die eine Vielzahl von Proteinfunktionen, einschließlich ihrer biochemischen Aktivität, subzelluläre Lokalisierung, Konformation und Stabilität regulieren katalysiert. Die Identifizierung von Phosphorylierungsstellen auf Zielproteine können durch tryptische Phosphopeptid Kartierung oder jetzt Standard Proteomics Techniken unter Verwendung von Proben für die phosphorylierten Peptide 1,2 angereichert erreicht werden. Während drei Viertel der zum Ausdruck Proteom sollen phosphoryliert 3 und eine identifizierte 200.000 Phosphorylierungsstellen 5, wobei die Schätzungen bis zu 1 Mio. 6, viele von ihnen haben keine zugewiesenen Biologie, Signalwegs oder Proteinkinase.
Während Identifizierung der phosphorylierten Websites ist relativ einfach, eine vergleichsweise größere Herausforderung ist es,identifizieren die verwandten Kinase (n), dass diese Seiten abzielt, ein Prozess, wir als Mapping-Kinase: Substrat-Paare. Mehrere Ansätze zum Identifizieren von Kinase: Substrat-Paare beschrieben wurden, entweder ausgehend von einer Kinase von Interesse und der nach seiner Substrate oder beginnend mit einem Substrat von Interesse und zu versuchen, eine modifizierende Kinase experimentell 7-11 oder rechnerisch 12 finden. Kinasen für eine bekannte phosphorylierte Substrat identifizieren kann Bioinformatik verwendet, um Proteine, die eine kurze konservierte Aminosäuresequenz flankieren den phosphorylierten Rest (der Konsensusstelle), sowie die Identifizierung Kinasen, die einen präzipitierbaren Komplex mit dem Substrat enthalten identifizieren. Allerdings sind diese Ansätze zeitaufwendig und oft nicht von Erfolg gekrönt.
Wir entwickelten eine systematische funktionalen Ansatz schnell zu identifizieren Kinasen, die eine gegebene Substrat 13 phosphorylieren kann. Der Bildschirm Assay produziert hervorragende spezifischekeit, mit sehr klaren Auswahl für eine mögliche verwandte Kinasen. Angesichts der Zentralität der Phosphorylierung an biologischen Signal, der Bildschirm ist nützlich für die Entdeckung in nahezu allen Zellsignalwege 14-16. Der Bildschirm beinhaltet die Durchführung einer großen Kinase-Assay mit einer Bibliothek von menschlichen Proteinkinasen. Die Kinasen wurden mit bakteriellen Glutathion-S-Transferase (GST) -Protein, markiert worden und werden aus Säugetierzellextrakten gereinigt ist, was bedeutet, daß die rekombinanten Enzyme – im Gegensatz zu den aus Bakterien hergestellt, – in Gegenwart der vorgeschalteten Proteinkinasen oft die erforderliche erzeugten rekombinante Enzyme Aktivität haben in vitro. Tatsächlich, während Serin, Threonin und Tyrosin Kinaseaktivität für nachgeschaltete Kinaseaktivierung in Hefe 10 vorhanden sind, codiert das Hefegenom 122 Proteinkinasen, die anzeigt, dass die Säuger Kinoms, mit mehr als 500 Gene 17 ist wesentlich komplexer zu werden, um Regulate die Prozesse eindeutig höherer Ordnung Organismen. Darüber hinaus kann die Wirkung der relevanten Zellbiologie und menschlichen Erkrankungen (wie beispielsweise kleinen Molekülen, Wachstumsfaktoren, Hormone, etc.) verschiedene Reize zu 14,15 modulate Kinase-Aktivität in einem geeigneten Kontext eingesetzt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Seit den ursprünglichen Veröffentlichungen über den Ansatz 14,15 ist die ursprüngliche Bibliothek 180 GST-Kinasen wurden in 420 Mitglieder oder ~ 80% des menschlichen Protein Kinoms erweitert. Der erweiterte Bibliothek, die wie beschrieben Protokoll dauert 4-5 Tage und dann 1-4 Tage, um Filme zu entwickeln (wie dies notwendig erscheint), die durch die Verwendung von Phosphorimaging und digitale Signalverstärkung verkürzt werden konnte. Es gibt mehrere wichtige Schritte, bei denen darauf geachtet werden …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NSERC Zuschuss unterstützt 386634. Wir möchten die Mitglieder des Screaton Lab für hilfreiche Diskussionen danken.
Materials
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 uL) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 uL) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 mL) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2X SDS lysis buffer (100 mL) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
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