Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening
Summary
Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.
Abstract
Abbiamo sviluppato una piattaforma di screening per identificare proteine chinasi dedicati umani per substrati fosforilati che possono essere utilizzati per delucidare nuovi percorsi di trasduzione del segnale. Il nostro approccio è caratterizzato dall'uso di una libreria di purificate protein chinasi umana GST-tag e una proteina ricombinante di interesse substrato. Abbiamo utilizzato questa tecnologia per identificare MAP / microtubuli affinità regolazione chinasi 2 (MARK2) come chinasi per un sito di glucosio-espresso nelle CREB-regolato trascrizionale coattivatore 2 (CRTC2), una proteina necessaria per la proliferazione delle cellule beta, nonché la famiglia di tirosina chinasi Axl come regolatori di metastasi delle cellule di fosforilazione della proteina dell'adattatore ELMO. Descriviamo questa tecnologia e discutiamo come può aiutare a stabilire una mappa completa di come le cellule rispondono agli stimoli ambientali.
Introduction
Proteina modificazioni post-traduzionali (PTM) sono essenziali per la comunicazione intracellulare. Forse il più studiato di tutti PTM è fosforilazione, catalizzata da proteina chinasi, che regolano una miriade di funzioni proteiche, compresa la loro attività biochimica, localizzazione subcellulare, conformazione e stabilità. L'individuazione dei siti di fosforilazione di proteine bersaglio può essere eseguito la mappatura fosfopeptide trittico o mediante tecniche di proteomica ormai standard che utilizzano i campioni arricchito da peptidi fosforilati 1,2. Mentre tre quarti del proteoma espresso dovrebbero essere fosforilata 3 e identificate 200.000 siti di fosforilazione 5, con stime fino a 1 milione 6, molti di questi non hanno biologia assegnato, percorso di segnalazione, o proteine chinasi.
Mentre individuazione dei siti fosforilazione è relativamente semplice, una sfida comparativamente più grande è quella diidentificare la chinasi affine (s) che gli obiettivi di questi siti, un processo che chiamiamo mappatura chinasi: coppie di substrato. Diversi approcci per identificare chinasi: coppie di substrato sono stati descritti, sia partendo con una chinasi di interesse e cerchi suoi substrati o iniziare con un substrato di interesse e il tentativo di trovare una chinasi modificante sperimentalmente 7-11 o computazionalmente 12. Per identificare chinasi per un noto substrato fosforilato, bioinformatica possono essere utilizzate per identificare le proteine che contengono una breve sequenza di amminoacidi conservati che fiancheggiano il residuo fosforilato (sito consensus), nonché individuare chinasi che formano un complesso precipitable con il substrato. Tuttavia, questi approcci sono in termini di tempo e spesso non hanno successo.
Abbiamo sviluppato un approccio funzionale sistematica di individuare rapidamente chinasi che può fosforilare un determinato substrato 13. Il saggio schermo produce eccellente specificolità, con molto chiara selezione di potenziali chinasi affini. Data la centralità della fosforilazione di segnalazione biologica, lo schermo è utile per la scoperta in quasi tutti i cellulari vie di segnalazione 14-16. Lo schermo comporta l'esecuzione di un test chinasi larga scala con una libreria di proteine chinasi umani. Le chinasi sono state contrassegnate con glutatione batterica S-transferasi (GST) proteine e sono purificato da estratti cellulari di mammifero, il che significa che gli enzimi ricombinanti – a differenza di quelli preparati da batteri – sono generati in presenza delle proteine chinasi a monte spesso necessari per la enzimi ricombinanti hanno attività in vitro. Infatti, mentre l'attività della chinasi serina, treonina e tirosina per l'attivazione della chinasi a valle sono presenti nel lievito 10, il genoma di lievito codifica 122 protein chinasi, indicando che il kinome mammiferi, con oltre 500 geni 17, è diventato molto più complesso per regulaTE i processi unici per gli organismi di ordine superiore. Inoltre, l'effetto di diversi stimoli rilevanti alla biologia cellulare e malattie umane (quali piccole molecole, fattori di crescita, ormoni, ecc) può essere utilizzato per attività chinasica 14,15 modulate in un contesto appropriato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Poiché le pubblicazioni originali descrivono l'approccio 14,15, la libreria originale di 180 GST-chinasi è stata ampliata per 420 membri, o ~ 80% della proteina kinome umana. Con la libreria espanso, il protocollo come descritto richiede 4-5 giorni e poi 1-4 giorni per sviluppare film (se ritenuto necessario), che può essere ridotto mediante l'uso di phosphorimaging e valorizzazione segnale digitale. Ci sono diversi passaggi chiave in cui occorre prendere cura (vedi figura 1 per un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da NSERC concessione 386634. Vorremmo ringraziare i membri della Screaton Lab per le discussioni utili.
Materials
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 uL) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 uL) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 mL) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2X SDS lysis buffer (100 mL) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
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