Идентификация киназы-подложки пар Использование высокопроизводительного скрининга
Summary
Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.
Abstract
Мы разработали платформу скрининга для выявления специальные протеинкиназы человека для фосфорилированных субстратов, которые могут быть использованы для выяснения новых путей передачи сигнала. Наш подход имеет применение библиотеки очищенных GST-меченый человека протеинкиназ и рекомбинантного белкового субстрата, представляющего интерес. Мы использовали эту технологию, чтобы идентифицировать MAP / микротрубочек сродства регулирования киназы 2 (Mark2), как киназы для глюкозы регулируется сайта на CREB-застройку транскрипционных коактиватора 2 (crtc2), белок, необходимый для пролиферации бета-клеток, а также Эксл семейство тирозинкиназ в качестве регуляторов клеточного метастазов по фосфорилирования белка адаптера ELMO. Мы описываем эту технологию и обсудить, как он может помочь создать комплексную карту, как клетки реагируют на стимулы окружающей среды.
Introduction
Белковые посттрансляционных модификаций (PTMs) имеют важное значение для внутриклеточного связи. Возможно, лучше всего изучен всего PTMs является фосфорилирование, катализируемое протеинкиназ, которые регулируют множество белковых функций, в том числе их биохимической активности, субклеточном локализации, конформации и стабильности. Идентификация сайтов фосфорилирования на целевых белков может быть достигнуто путем трипсином отображения фосфопептидного либо теперь стандартными методами с использованием протеомическим образцы обогащенные для фосфорилированных пептидов 1,2. В то время как три четверти выраженной протеома, как ожидается, будет фосфорилируется 3 и определены сайты фосфорилирования 200000 5, с оценками до 1 млн 6, многие из них не имеют назначенного биологию, путь, или протеинкиназы сигнализации.
В то время как идентификация фосфорилированными сайтов является относительно простым, сравнительно больше, задача состоит вопределить родственный киназы (ы), что цели эти сайты, процесс мы называем отображения киназы: пар подложки. Существует несколько подходов для определения киназы: пары подложек были описаны, либо начиная с киназы интереса и ищет ее субстратами или начиная с подложкой интереса и пытается найти модифицирующий киназу экспериментально 7-11 или вычислительно 12. Чтобы определить киназы для известного фосфорилированного субстрата, биоинформатики могут быть использованы для идентификации белков, которые содержат короткий консервативную последовательность аминокислот, фланкирующих фосфорилированный остаток (консенсус-сайта), а также определение киназы, которые образуют осаждаемой комплекс с подложкой. Тем не менее, эти подходы требуют много времени и часто не увенчались успехом.
Мы разработали системный функциональный подход быстро определить киназы, которые могут фосфорилировать данную подложку 13. Экран анализа производит отличную специфику, с очень ясным отбора потенциальных родственных киназ ность. Учитывая центральное фосфорилирования биологического сигнализации, экран полезен для открытия практически во всех клеточных сигнальных путей 14-16. Экран включает в себя проведение крупномасштабной киназы с библиотекой протеинкиназ человека. Киназы были помечены бактериальной глутатион S-трансферазы (GST) белка и очищают от млекопитающих клеточных экстрактов, что означает, что рекомбинантные ферменты – в отличие от тех, полученного из бактерий – генерируются в присутствии вверх по течению протеинкиназ часто требуемых для рекомбинантных ферментов обладают активностью в пробирке. Действительно, в то время как серин, треонин и тирозин киназы для активации нижнего киназы присутствуют в дрожжах 10, геном дрожжей кодирует 122 протеинкиназы, указывая, что kinome млекопитающих, более 500 генов 17, стало значительно сложнее, чтобы Регулат.е процессы, уникальные для более высокого порядка организмов. Кроме того, влияние различных стимулов, имеющих отношение к клеточной биологии и болезни человека (например, небольших молекул, факторов роста, гормонов и т.д.) могут быть использованы для модулирования 14,15 киназной активности в соответствующем контексте.
Protocol
Representative Results
Discussion
С оригинальных публикаций, описывающих подход 14,15, оригинальная библиотека 180 GST-киназы был расширен до 420 членов, или ~ 80% от kinome белка человека. С расширенной библиотеки, протокол, как описано занимает 4-5 дней, а затем 1-4 дней, чтобы развивать фильмы (по мере необходимости), которая мо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом NSERC 386634. Мы хотели бы поблагодарить членов Screaton Lab за полезные обсуждения.
Materials
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 uL) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 uL) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 mL) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2X SDS lysis buffer (100 mL) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
- Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS chem. 10, 63-71 (2015).
- Sharma, K., et al. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation–a 25 year update. Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).
- Walsh, C. T. . Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature’s Inventory. , (2006).
- Boersema, P. J., et al. In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling. Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).
- Hutti, J. E., et al. A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity. Nat Methods. 1, 27-29 (2004).
- Johnson, S. A., Hunter, T. Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nat Methods. 2, 17-25 (2005).
- Pawson, T., Nash, P. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300, 445-452 (2003).
- Zhu, H., et al. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet. 26, 283-289 (2000).
- Shah, K., Shokat, K. M. A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases. Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).
- Zou, L., et al. PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites. BMC bioinform. 14, 247 (2013).
- Varjosalo, M., et al. Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling. Cell. 133, 537-548 (2008).
- Jansson, D., et al. Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).
- Fu, A., Screaton, R. A. Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family. Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).
- Abu-Thuraia, A., et al. Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion. Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
