Identificación de los pares quinasa-sustrato Usando selección de alto rendimiento
Summary
Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.
Abstract
Hemos desarrollado una plataforma de cribado para identificar proteínas quinasas humanos dedicados para sustratos fosforilados que pueden utilizarse para dilucidar nuevas vías de transducción de señales. Nuestro enfoque ofrece el uso de una biblioteca de proteínas quinasas humana marcada con GST purificada y un sustrato de proteína recombinante de interés. Hemos utilizado esta tecnología para identificar MAP / microtúbulos afinidad de regulación de quinasa 2 (MARK2) como la quinasa para un sitio regulada por glucosa en CREB-regulado transcripcional Coactivador 2 (CRTC2), una proteína necesaria para la proliferación de células beta, así como la la familia de tirosina quinasas de Axl como reguladores de la metástasis de las células por la fosforilación de la proteína adaptador de ELMO. Se describe esta tecnología y discutimos cómo puede ayudar a establecer un mapa completo de cómo las células responden a estímulos ambientales.
Introduction
Proteína modificaciones post-traduccionales (PTMs) son esenciales para la comunicación intracelular. Tal vez el mejor estudiado de todos PTM es la fosforilación, catalizada por proteínas quinasas, que regulan una gran variedad de funciones de proteínas, incluyendo su actividad bioquímica, localización subcelular, conformación, y la estabilidad. La identificación de sitios de fosforilación en las proteínas diana se puede lograr mediante mapeo de fosfopéptidos trípticos o mediante técnicas proteómicas ahora estándar usando muestras enriquecidas para los péptidos fosforilados 1,2. Aunque se espera que tres cuartas partes del proteoma expresado ser fosforilados 3 y un identificaron 200.000 sitios de fosforilación 5, con estimaciones de hasta 1 millón 6, muchos de éstos no tienen asignada la biología, la vía de señalización, o la proteína quinasa.
Mientras que la identificación de sitios fosforilados es relativamente sencillo, una comparativamente mayor reto esidentificar la quinasa cognado (s) que se dirige a estos sitios, un proceso que nos referimos como mapeo de quinasa: sustrato pares. Varios enfoques para la identificación de quinasa: sustrato pares se han descrito, ya sea comenzando con una quinasa de interés y en busca de sus sustratos o comenzar con un sustrato de interés y tratando de encontrar una quinasa de modificación experimentalmente 7-11 o computacionalmente 12. Para identificar quinasas para un sustrato fosforilado conocido, la bioinformática se pueden utilizar para identificar las proteínas que contienen una secuencia corta conservada de aminoácidos que flanquean el residuo fosforilado (el sitio consenso), así como la identificación de quinasas que forman un complejo con el sustrato precipitable. Sin embargo, estos métodos requieren mucho tiempo ya menudo no cumplen con éxito.
Hemos desarrollado un enfoque funcional sistemático para identificar rápidamente quinasas que pueden phosphorylate un sustrato dado 13. El ensayo de la pantalla produce una excelente específicadad, con una selección muy claro para los posibles quinasas afines. Dada la centralidad de la fosforilación de la señalización biológica, la pantalla es útil para el descubrimiento de rutas de señalización prácticamente todos los teléfonos 14-16. La pantalla implica la realización de un ensayo de quinasa a gran escala con una biblioteca de proteínas quinasas humanas. Las quinasas han sido etiquetadas con glutatión bacteriana S-proteína transferasa (GST) y se purificó a partir de extractos de células de mamíferos, lo que significa que las enzimas recombinantes – a diferencia de los preparados a partir de bacterias – se generan en presencia de las proteínas quinasas aguas arriba a menudo requeridos para la enzimas recombinantes que tienen actividad in vitro. De hecho, mientras que la actividad quinasa de serina, treonina y tirosina requiere para la activación de la quinasa aguas abajo están presentes en la levadura 10, el genoma de la levadura codifica 122 proteínas quinasas, lo que indica que el kinome de mamífero, con más de 500 genes 17, ha llegado a ser significativamente más compleja con el fin de regulate La procesos únicos para los organismos de orden superior. Por otra parte, el efecto de diferentes estímulos relevantes a la biología celular y la enfermedad humana (por ejemplo, moléculas pequeñas, factores de crecimiento, hormonas, etc.) se puede utilizar para modular la actividad de quinasa 14,15 en un contexto apropiado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desde las publicaciones originales que describen el enfoque 14,15, la biblioteca original de 180 GST-quinasas se ha ampliado a 420 miembros, o ~ 80% de la kinome proteína humana. Con la biblioteca ampliada, el protocolo como se describe toma 4-5 días y después de 1-4 días para desarrollar películas (según se considere necesario), lo que podría ser acortada mediante el uso de phosphorimaging y mejora de la señal digital. Hay varios pasos clave en las que se debe tener cuidado (Ver Figura 1</str…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la beca NSERC 386634. Nos gustaría dar las gracias a los miembros del Laboratorio Screaton útil para los debates.
Materials
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 uL) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 uL) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 mL) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2X SDS lysis buffer (100 mL) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
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