Identifiering av kinas-substrat par Använda högkapacitetsscreening
Summary
Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.
Abstract
Vi har utvecklat en screening plattform för att identifiera särskilda humana proteinkinaser för fosforylerade substrat som kan användas för att belysa nya signaltransduktionsvägar. Vårt tillvägagångssätt har användningen av ett bibliotek av renade GST-märkt humant proteinkinaser och ett rekombinant proteinsubstrat av intresse. Vi har använt denna teknik för att identifiera MAP / mikrotubul affinitetsreglerande kinas 2 (MARK2) som kinaset för en glukosreglerad ställe på CREB-Regulated Transkriptionell samaktivator 2 (CRTC2), ett protein som erfordras för betacellsproliferation, liksom den Axl familj av tyrosinkinaser som regulatorer av cellmetastaser genom fosforylering av adaptorproteinet ELMO. Vi beskriver denna teknik och diskutera hur den kan bidra till att skapa en heltäckande karta över hur celler svarar på stimuli från omgivningen.
Introduction
Proteinposttranslationella modifieringar (PTMs) är väsentliga för intracellulär kommunikation. Kanske bäst studerade av alla PTMs är fosforylering, katalyseras av proteinkinaser, som reglerar en myriad av proteinfunktioner, inklusive deras biokemisk aktivitet, subcellulär lokalisering, gestaltning och stabilitet. Identifieringen av fosforyleringssäten på målproteiner kan åstadkommas genom tryptisk fosfopeptidmappning eller genom nu standardiserade proteomik tekniker med användning av prover berikade för fosforylerade peptider 1,2. Medan tre fjärdedelar av den uttryckta proteomet förväntas fosforyleras 3 och en identifierad 200.000 fosforyleringssäten 5, med uppskattningar upp till 1 miljon 6, många av dessa har ingen tilldelad biologi, signalväg eller proteinkinas.
Medan identifiering av fosforylerade platser är relativt enkelt, en jämförelsevis större utmaning är attidentifiera besläktade kinas (s) som riktar sig mot dessa platser, en process som vi kallar kartläggning kinas: substratpar. Flera metoder för att identifiera kinas: substratpar har beskrivits, antingen börjar med ett kinas av intresse och letar efter sina substrat eller starta med ett substrat av intresse och försöka hitta en modifierande kinas experimentellt 7-11 eller beräknings 12. För att identifiera kinaser för en känd fosforylerat substrat, kan bioinformatik användas för att identifiera proteiner som innehåller en kort konserverad sekvens av aminosyror som flankerar den fosforylerade resten (konsensus plats), samt att identifiera kinaser som bildar ett utfällningsbart komplex med substratet. Men dessa metoder är tidskrävande och ofta inte uppfyller med framgång.
Vi utvecklade ett systematiskt funktionellt synsätt för att snabbt identifiera kinaser som kan fosforylerar ett givet substrat 13. Analys skärm ger utmärkt specifikhet, med mycket tydliga val för potentiella besläktade kinaser. Med tanke på den centrala roll fosforylering biologiska signalering, är skärmen användas för upptäckt i så gott som alla cellsignalvägar 14-16. Skärmen innefattar att genom en storskalig kinasanalys med ett bibliotek av humana proteinkinaser. Kinas har märkts med bakteriellt glutation-S-transferas (GST) protein och renas från cellextrakt däggdjurs, vilket betyder att de rekombinanta enzymerna – till skillnad från de som framställts från bakterier – alstras i närvaro av de uppströms proteinkinaser ofta krävs för rekombinanta enzymerna ha aktivitet in vitro. Faktum medan serin, treonin och tyrosin-kinasaktivitet som erfordras för nedströms-kinasaktivering är närvarande i jäst 10, kodar jästgenomet 122 proteinkinaser, vilket tyder på att däggdjurs kinome, med över 500 gener 17, har blivit avsevärt mer komplex för att Regulate processerna är unika för högre ordningens organismer. Dessutom kan effekten av olika stimuli som är relevanta för cellbiologi och mänskliga sjukdomar (såsom små molekyler, tillväxtfaktorer, hormoner, etc.) användas till 14,15 modulerar kinasaktivitet i ett lämpligt sammanhang.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eftersom de ursprungliga publikationer som beskriver tillvägagångssättet 14,15, har det ursprungliga biblioteket 180 GST-kinaser utökats till 420 medlemmar, eller ca 80% av det humana proteinet kinome. Med den utökade biblioteket, protokollet som beskrivs tar 4-5 dagar och sedan 1-4 dagar att utveckla filmer (som anses nödvändigt), vilket skulle kunna förkortas genom användning av phosphorimaging och digital signalförstärkning. Det finns flera viktiga steg där man måste vidtas (se</strong…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NSERC bidrag 386634. Vi vill tacka medlemmarna i Screaton Lab för bra diskussioner.
Materials
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 uL) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 uL) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 mL) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2X SDS lysis buffer (100 mL) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
- Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS chem. 10, 63-71 (2015).
- Sharma, K., et al. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation–a 25 year update. Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).
- Walsh, C. T. . Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature’s Inventory. , (2006).
- Boersema, P. J., et al. In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling. Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).
- Hutti, J. E., et al. A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity. Nat Methods. 1, 27-29 (2004).
- Johnson, S. A., Hunter, T. Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nat Methods. 2, 17-25 (2005).
- Pawson, T., Nash, P. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300, 445-452 (2003).
- Zhu, H., et al. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet. 26, 283-289 (2000).
- Shah, K., Shokat, K. M. A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases. Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).
- Zou, L., et al. PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites. BMC bioinform. 14, 247 (2013).
- Varjosalo, M., et al. Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling. Cell. 133, 537-548 (2008).
- Jansson, D., et al. Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).
- Fu, A., Screaton, R. A. Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family. Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).
- Abu-Thuraia, A., et al. Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion. Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
