Viabilidad de Bioprinted celulares Construye El uso de un Tres Impresora cartesiana dispensador

Summary

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Abstract

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

Introduction

La ingeniería de tejidos utiliza los principios de la biología y la ingeniería en el desarrollo de sustitutos funcionales para mantener, restaurar o mejorar tejido nativo y. La capacidad de generar construcciones biomiméticos tridimensionales en la demanda que facilitaría los avances científicos y tecnológicos en la ingeniería de tejidos, así como en los sensores basados ​​en células, drogas / detección de toxicidad, modelos tisulares o tumorales, y otra. La organización tridimensional de construcciones de ingeniería tisular es un componente fundamental del método de fabricación, ya que debe imitar de cerca la interacción altamente organizada de las células y la matriz extracelular en el tejido nativo.

Andamios tridimensionales biodegradables y forma de formación son factores críticos en la generación de nuevas construcciones de tejido ya que las células migran para formar una capa de dos dimensiones de las células, pero carecen de la capacidad de crecer en favorecida tridimensional. El andamio sirve como una base temporal para la célulael apego y la proliferación, por lo que debe ser construido a partir de materiales con porosidad y biodegradabilidad controlable, y suficiente integrit mecánica. Los materiales de andamiaje no deben ser citotóxico o crear una respuesta adversa del huésped. Los hidrogeles han sido utilizados comúnmente en las técnicas de ingeniería de tejidos, y debido a su hidrofilia, los hidrogeles permitir el intercambio de líquido y gas en todo el structur. Mediante la combinación de diferentes hidrogeles, las propiedades del hidrogel sintetizados se pueden modificar para cumplir el requisito de aplicación distinta.

El enfoque de la ingeniería de tejidos convencional consiste en la creación de andamios porosos de sacrificio acelular que se sembraron con células post-fabricatio. Muchas técnicas se han empleado, tales como unión de fibras, colada con disolvente, y se funden piezas de fundición, pero resultó ser mínimamente éxito para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Métodos de unión de fibra permiten fibras para estar alineados en formas específicas, sino que sólo son capaces de producing andamio muy delgada. Métodos de fundición de disolvente produjeron construcciones altamente porosas, sin embargo la membrana producido más grande fue sólo de 3 mm thic. Por lo tanto, la creación de construcciones tridimensionales no es factible el uso de estas técnicas. Técnicas de moldeo en estado fundido tuvieron éxito en la producción de andamios tridimensionales, pero se requieren temperaturas tan altas que los materiales biológicos no pueden ser incorporados durante el proces de producción. Los andamios sembrados después de la fabricación están limitados en su capacidad para cumplir los requisitos de la ingeniería de tejidos para producir andamios tridimensionales con microestructuras pre-definidos o controlables y. Otro problema importante con las tecnologías de siembra andamio sólidos es la deficiencia de la vascularización y la mala mecánica.

Bioprinting desde entonces se ha extendido a tres dimensiones mediante el uso de, geles termo-reversible no tóxicos y biodegradables para superar las desventajas de la convencional. Algunos de los sólidos de forma libre fabricación techniques siendo empleadas actualmente son bioprinting y de inyección de tinta de impresión láser asistida. Técnicas bioprinting asistida por láser utilizan una fuente pulsada láser, una placa de destino, y un sustrato de recepción para generar tridimensional. Sin embargo, esta técnica está limitada debido a la baja el rendimiento, la viabilidad celular baja, y sólo puede producir arreglos limitadas de estructuras fabricadas porque sólo prepolímeros fotorreticulables pueden ser utilizados para formar un hidrogel reticulado. La impresión de inyección de tinta fue desarrollado como una metodología sin contacto que reproduce datos de imagen digital sobre un sustrato mediante el depósito de tinta picolitros. Sin embargo, la impresión de inyección de tinta no produce un constructo de alta resolución, construye experiencia rápida desnaturalización de las proteínas, y muchas de las células se lisan durante la deposición.

En la actualidad, se han desarrollado nuevos métodos de fabricación bioprinting aditivo. En estos sistemas de células, proteínas, factores de crecimiento, e hidrogeles biomiméticos son típicamente integrados en mater matrizmate- durante el proceso de fabricación y al mismo tiempo depositado utilizando actuadores controlados por el ordenador para generar constructos de células cargado a base de andamios tridimensionales que imitan estrechamente la microarquitectura del nativa. Los hidrogeles de células cargados constituyen la bioink, que puede ser heterogéneo, que consta de múltiples tipos de células, o homogénea. Aditivo sistemas de fabricación depósito bioink gota a gota o capa por capa a través de jeringas desechables y consejos a un escenario controlado por ordenador capaz de moverse en las direcciones x, y, z. A través de los programas informáticos, la arquitectura de andamios impresos puede ser fácilmente manipulado en función de los requisitos de la aplicación. A diferencia de las técnicas convencionales, tecnologías médicas tridimensionales (imágenes por resonancia magnética, tomografía computarizada) se pueden incorporar en los diseños, la generación de construcción específica del paciente. Estos métodos también permiten la posibilidad de producir reemplazos vascularizados porque construcciones se producen con una l mayordensidad celular vecinal, permitiendo interacciones célula-célula y la mejora de la probabilidad de Surviva post-implantación.

La impresora Palmetto es un sistema multi-dispensador tridimensional hecha a la medida que utiliza métodos programables fabricación robóticos para generar construcciones de tejido heterogéneo en tres dimensiones (Figura 1). Se permite el uso de una pluralidad de materiales en combinaciones únicas para producir estructuras heterogéneas. La inicialización del bioprinter es uno de los pasos más importantes en bioprinting porque le permite establecer una serie de parámetros para optimizar la capacidad de impresión de los constructos bioprinted.

El bioprinter comprende un proceso de tipo discontinuo con secuencias de arranque, funcionamiento y apagado controlado por un controlador lógico programable (PLC), que el usuario opera a través de un panel de control de pantalla táctil interactiva (Figura 1, A). Para evitar la contaminación de biomateriales lógicos del bioprinter está encerrado en un poli positivamente-presionados (metacrilato de metilo) (PMMA) con una cámara de arrestancia partículas de alta eficiencia (HEPA) -filtered sistema de circulación de aire (Figura 1, B, C). El interior de la impresora se puede esterilizar utilizando las fuentes de luz ultravioleta incorporados en la (Figura 1, D). El componente central de la bioprinter es un robot de posicionamiento totalmente programable que se puede colocar de manera reproducible una punta del dispensador con una precisión de 10 micrómetros (Figura 1, E). Hay tres dispensadores, que son capaces de depositar volúmenes tan pequeños como 230 nl utilizando un tornillo rotativo (Figura 1, F). Ellos son independientemente programable utilizando equipos independientes que gobiernan los parámetros de impresión para cada dispensador (Figura 1, G). Dispensación Rotary-tornillo utiliza la rotación de un tornillo accionado por motor para mover hacia abajo bioink una jeringa y fuera de la punta de la jeringa. Estos dispensadores están montados sobre una neumáticaNest Herramienta Ly controlado (Figura 2A, B), permitiendo que el robot para cambiar dispensador montado en el brazo robótico del eje Z bajo control programado (Figura 1, H).

El robot XYZ recibe instrucciones de impresión desde un equipo que ejecuta el software de diseño (Figura 1, I). Cada programa contiene ubicaciones de dispensación, las rutinas de calibración, y protocolos dispensador cambiante. El diseño de las construcciones generadas principalmente consiste en las coordenadas XYZ, donde cada dispensador depositará material. El bioprinter comprende dos sensores de luz ópticos (Figura 2C) que determinan las coordenadas XYZ del extremo de la punta de la jeringa. Estos sensores envían información de coordenadas para el robot, que las utiliza para calcular las posiciones de los extremos de punta del dispensador. Hay un láser de desplazamiento adicional (Figura 2D) que proyecta un diodo de 633 nm rayo láser rojo del tamaño del punto 30 x 100 micrómetros para medir la distancia con un Accuracy de 0,1 micrómetros. Cuando el haz está muy centrado el robot determina la distancia Z de la superficie de impresión. Esta medición, y la medición de los sensores de luz óptica de la extremo de la punta en Z, permite el cálculo de Z precisa coordenadas utilizadas para colocar la punta del dispensador en relación con la superficie de impresión. Las puntas de dosificación se mueven lateralmente y verticalmente a través del sensor de luz óptica orientada eje X para encontrar los centros Y y Z, y lateralmente a través de un sensor de eje Y para encontrar el centro del eje X. La superficie de impresión se asigna utilizando la fórmula para un plano en el espacio xyz: ax + by + cz = d para determinar donde la superficie es relativa a la posición del extremo de la punta de dispensación. La etapa de la impresora (Figura 1, J) tiene una muestra de placa de Petri de hasta 80 mm de diámetro y utiliza un baño de agua de recirculación para mantener la temperatura de ajuste (Figura 1, K). Etapa temperatura puede ajustarse dentro de un rango de -20 y permanece estable dentro. Hay una cámara USB montadoen el robot Z-brazo para proporcionar una vista ampliada de la punta dispensadora durante el proceso de impresión (Figura 1, L). Hay una segunda cámara montada hacia la parte superior del interior de la cámara que proporciona una visión completa de la bioprinter durante el proceso de impresión (Figura 1, L).

Un software de dibujo diseño asistido por ordenador determina el patrón de deposición y permite al usuario generar gotas espaciadas de forma incremental y estructuras complejas (Figura 3). Vías tridimensionales pueden ser codificados manualmente en el software de diseño compatible con la impresora o importados de un software independiente de dibujo asistido por ordenador de diseño (Figura 4, Tabla 1). El software compatible con la impresora permite variaciones de los parámetros de impresión tales como el método de deposición (single deposición de gotas o la deposición vía continua), la geometría tridimensional de las vías, velocidad de deposición, distancia entre el extremo de la punta de la jeringa y substsuperficie de impresión tasa, la cantidad de tiempo para depositar una gota individual, y la altura y la velocidad de la jeringa se levanta entre la deposición de las gotas. Cada programa contiene XYZ ubicaciones de dispensación, las rutinas de calibración punta y protocolos dispensador de cambio para proporcionar un ambiente estéril, sin intervención del operador, durante la impresión. El controlador lógico programable (PLC) del robot recibe instrucciones del equipo que ejecuta el software de diseño y controla el tiempo de los eventos de los controladores externos (por ejemplo, los dispensadores). Para ello, el PLC utiliza un mecanismo de bucle para controlar los dispensadores , dispositivo de posicionamiento robótico, y los factores ambientales.

Tridimensional bioprinting-escritura directa utilizando un sistema de dispensación de líquido rotativo de tornillo permite que el proceso de depositar las células a ser más eficiente, precisa y fácil que los métodos anteriores. Este estudio muestra la bioprinter hecha a la medida es capaz de generar ceconstrucciones de hidrogel-ll cargados con alta viabilidad celular.

Protocol

1. Preparación de la gelatina sustrato que contiene para tridimensional Bioprinting de alginato hidrogeles Prepare el substrato de calcio / gelatina siguiendo el método de sustrato de calcio / gelatina descrito por Pataky et al 11 para evitar la viabilidad reducida asociada con alto contenido. El método de sustrato de calcio / gelatina se encuentra a continuación. Combinar dihidrato de cloruro de calcio (1,5% en peso), cloruro de sodio (0,9% en peso), y la gelatina porcina (2%…

Representative Results

Los resultados demuestran la bioprinter es capaz de depositar hidrogeles de células cargado en ubicaciones tridimensionales específicas precisa y consistente utilizando el software asistido por ordenador. Estos programas determinan la colocación de cada gotita y controlan muchos de los parámetros para la distribución (Figura 3,4). La repetibilidad del bioprinter para depositar apropiadamente biomateriales es fundamental para su éxito en aplicaciones de ingeniería tisular. <p class="jove_conte…

Discussion

El enfoque principal de la ingeniería de tejidos es cerrar la brecha entre la escasez de órganos y necesidades de trasplante mediante el desarrollo de sustitutos biológicos capaces de restaurar, mantener o mejorar functio tejido nativo. Esto ha llevado a la fabricación directa de andamios con un complejo, geometría externa anatómicamente correcta, y el control preciso sobre el Geometr interna. Bioprinting tridimensional es una metodología utilizada para generar construcciones tridimensionales de diversos tamaños…

Materials

Positioning Robot (JR2000 XYZ)	Janome
Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers	Fishman Corporation
Optical Light Sensors:	Keyensce
Displacement Laser: OD Mini	SICK
Recirculating Water Bath: Polystat	Cole-Parmer	EW-12122-02
USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP	AnMo Electrionics/YSC Technologies	AD7013MT
Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points	Janome		Comes with purchase of Janome Robot
Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder	RatioServ		Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads
Printer 3 cc Syringes:	Fishman Corporation	122051
22 G Dispenser Tips	Fishman Corporation	Z520122
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	10035-04-8
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Porcine Gelatin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Titanium Dioxide	Sigma-Aldrich	13462-67-7
Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate)	FMC BioPolymer	9005-38-3
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	7647-01-0
Ethylene Glycol	Mallinckrodt Baker, Inc	9300-01
Sodium Periodate	Sigma-Aldrich	7790-28-5
hADSC	Lonza	PT-5006	Store in vials in liquid nitrogen until use.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Gibco Life Technologies	11965-092	Warm in 37°C water before use.
Trypsin/EDTA	Lonza	CC-5012	Warm in 37°C water before use.
Calcein AM	Gibco Life Technologies	C3100MP	Store in the dark at -80°C until use.
Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit	Invitrogen Life Technologies	L-3224	Store in the dark at -80°C until use.
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M2933
N-Hydroxysuccinimide	Sigma-Aldrich	130672
1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)	Sigma-Aldrich	E1769	10 G
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium	Life Technologies	14040133	Warm in 37°C water before use.
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium	Life Technologies	14190144	Warm in 37°C water before use.
RGD Peptides	International Peptides
Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain	Invitrogen Life Technologies	A22283	Store at -20°C until use
(4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain	Life Technologies	R37606	Store at -20°C until use