This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.
T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (µM range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on Förster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.
टी-कोशिकाओं एंटीजन की पहचान कैसे की एक और अधिक मौलिक समझ टी सेल और एपीसी के बीच का गठन प्रतिरक्षात्मक अन्तर्ग्रथन के भीतर, वह यह है कि सही जगह पर देख रहे हैं की आवश्यकता है। इधर, आणविक बाध्यकारी कैनेटीक्स केवल सेलुलर बलों, झिल्ली वास्तुकला और झिल्ली प्रोटीन के बीच पार्श्व बातचीत के साथ ही अन्तर्ग्रथन विशेष ज्यामितीय बाधाओं शामिल हैं, जो सेलुलर मापदंडों पर काफी हद तक निर्भर करती है लेकिन इसमें शामिल बातचीत के भागीदारों के निहित जैव रासायनिक गुणों द्वारा निर्धारित नहीं कर रहे हैं 3। जैव रासायनिक दृष्टिकोण वे शामिल अन्तर्ग्रथनी झिल्ली का कम से कम एक के विघटन की जरूरत के रूप में सत्ता का समाधान करने में सीमित कर रहे हैं। इस कारण एक झल्लाहट आधारित इमेजिंग कार्यप्रणाली प्रतिजनी pMHCs से 2 TCR के बंधन की निगरानी के लिए विकसित किया गया था। यहाँ टी कोशिकाओं को एक पुनः संयोजक से सजाया जाता है और साइट विशेष TCRβ प्रतिक्रियाशील एकल श्रृंखला एंटीबॉडी टुकड़ा (एससीएफ वी) लेबल और योजना के साथ सामना MHC वर्ग द्वितीय एक fluorescently लेबल प्रतिजनी पेप्टाइड के साथ भरी हुई अणुओं, costimulatory अणुओं और आसंजन प्रोटीन बंदरगाह जो एआर गिलास-समर्थित लिपिड bilayers (SLBs),। Synaptic कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी द्वारा एक थोक और एक अणु के स्तर पर नजर रखी जा सकती है, जो झल्लाहट में डाई लेबल TCR और डाई लेबल pMHC परिणाम है, के बीच बंधन।
इस लेख में यह टी-सेल synapses परख करने की क्रिया के लिए SLBs उपयोग एक कार्यात्मक टी सेल कैल्शियम प्रवाह परख के माध्यम से उनकी ईमानदारी को सत्यापित करने के लिए विस्तार से समझाया गया है, आचरण थोक में और एक अणु संवेदनशीलता के साथ माप झल्लाहट, और प्राप्त डेटा का विश्लेषण। अनुशंसाएँ बाईलेयर functionalization के लिए आवश्यक ठीक से पुष्टि प्रोटीन का उत्पादन करने की पेशकश कर रहे हैं। बाईलेयर गठन और एक उपयुक्त TIRF माइक्रोस्कोप 4 वापस करने के लिए वापस प्रकाशित एक अतिरिक्त सार्वजनिक उपयोग जौव प्रकाशन के लिए कृपया देखें की स्थापना के बारे में और अधिक विशिष्ट जानकारी के लिए।
तम्बू "> SLBs की प्रकृतिFunctionalizable SLBs आसानी से दो लिपिड 1-palmitoyl-2-oleoyl-एस.एन.-gylcero-3-phosphocholine युक्त unilamellar पुटिकाओं (एसयूवी) से उत्पन्न हो सकता है (कम: POPC, 90-99%) और 1,2-dioleoyl- एस.एन. – ग्लिसरो-3 – {[एन (5-अमीनो-1-carboxypentyl) iminodiacetic एसिड] succinyl} (लघु: डीजीएस NTA-नी, 1-10%)। स्वच्छ गिलास स्लाइड पर फैल एसयूवी एक सन्निहित तलीय बाईलेयर 4 के रूप में। डीजीएस-NTA-नी सिंथेटिक NTA-नी-युक्त सिर समूह (चित्रा 1 ए) के साथ polyhistidine की मध्यस्थता जटिल गठन के माध्यम से polyhistidine टैग प्रोटीन लंगर के लिए कार्य करता है। स्थिर संघ एक के लिए आम तौर पर आसंजन प्रोटीन ICAM -1 और बारह histidines (ICAM-1-12H, B7-1 -12H) युक्त एक टैग के साथ costimulatory अणु B7-1 के देशी transmembrane डोमेन और cytoplasmic पूंछ को बदल देता है (चित्रा 1 बी) । पेप्टाइड से भरी हुई वर्ग द्वितीय अणु आईई कश्मीर दो झिल्ली एम्बेडेड (α और β) पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला में शामिलएस। दोनों श्रृंखलाओं के ट्रांसमेम्ब्रेन / साइटोप्लास्मिक डोमेन छह histidines प्रत्येक (आईई कश्मीर α 6H β 6H या IE कश्मीर -2x6H) युक्त एक टैग के साथ प्रतिस्थापित किया जाना है। एक वैकल्पिक, बारह histidines साथ α श्रृंखला का विस्तार और untagged (12H β 0H या IE कश्मीर -12H α आईई कश्मीर को जन्म दे रही है) β श्रृंखला के बाह्य डोमेन छोड़ने के रूप में संतोषजनक परिणाम (चित्रा 1 बी) को जन्म देता है।
PMHCs की साइट विशेष लेबलिंग
यह सार्थक संतुलन बाध्यकारी स्थिरांक में झल्लाहट मापा पैदावार परिवर्तित करने में सक्षम होने के लिए आदेश में stoichiometrically और साइट विशेष pMHC लेबल करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस पुनः संयोजक हिस्टिडीन टैग MHC वर्ग द्वितीय अणुओं 2,5 की पेप्टाइड बाध्यकारी फांक में भरी हुई है कि एक सिंथेटिक पेप्टाइड की रासायनिक लेबलिंग के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। पेप्टाइड w के रूप में टी सेल मिलान के सभी अवशेष शामिलपक्ष सिस्टीन द्वारा पीछा किया एक छोटी सी टर्मिनल लिंकर (GGS) के रूप में (जैसे कीट साइटोक्रोम ग (एमसीसी) पेप्टाइड ANERADLIAYLKQATK- GGSC में, लिंकर बोल्ड में चिह्नित किया गया है)। इस सिस्टीन maleimide डाई डेरिवेटिव के उपयोग के साथ stoichiometrically पेप्टाइड लेबल करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस बिंदु पर अतिरिक्त ध्यान सिस्टीन युक्त पेप्टाइड मात्रात्मक डाई युग्मन की पुष्टि करने के लिए समर्पित किया जाना चाहिए। पेप्टाइड डाई अभिवर्तन का एचपीएलसी-शुद्धि की सिफारिश की है और electrospray आयनीकरण जन स्पेक्ट्रोस्कोपी के द्वारा पीछा किया जाना है। (डाई के बिना) पेप्टाइड educt के संगत किसी भी दर्ज की जनता अधूरा लेबलिंग दर्शाते हैं। अगर यह सच है लेबलिंग मात्रात्मक समझा जाता है, जब तक एचपीएलसी शुद्ध पेप्टाइड डाई लेबलिंग की लगातार राउंड के अधीन किया जाना चाहिए। इस विधि नमूना आयनीकरण के लिए लेजर विकिरण शामिल है के रूप में MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोस्कोपी से परहेज किया जाना चाहिए ध्यान दें। पेप्टाइड बड़े पैमाने पर इस प्रकार underrepre बाहर पढ़ने के लिए किया जाता है और इससे पहले इस उपचार जुड़ी संवेदनशील fluorophores विखंडित डाई-विकार के sents डिग्री।
मोनोवैलेन्ट एकल श्रृंखला एफ वी टुकड़े के उपयोग के साथ सेल बाध्य TCRs के अप्रत्यक्ष अभी तक साइट विशेष लेबलिंग
यह अभी भी एक साइट विशेष ढंग से जीवित कोशिकाओं की सतह से जुड़े प्रोटीन सेल रंगों संलग्न करने की चुनौती दे रहा है। सतह उजागर TCRs के लिए इस बाधा को दूर करने के लिए, TCRβ -reactive मोनोक्लोनल एंटीबॉडी H57-197 2 के जीन से एक मोनोवैलेन्ट एकल श्रृंखला संस्करण (एससीएफ वी) का निर्माण किया गया है। TCR के साथ परिसर में इस एंटीबॉडी की क्रिस्टल संरचना तर्क से (इसी झल्लाहट साथी डाई जुड़ा हुआ है जहां) एमएचसी जुड़े पेप्टाइड की सी टर्मिनस के करीब निकटता में एक सेरीन अवशेषों एक के लिए प्रतिस्थापित किया गया है, जिसमें एक संस्करण है, डिजाइन करने के लिए अनुमति देता है सिस्टीन अवशेषों। इस उत्परिवर्ती सिस्टीन तो डाई विकार (चित्रा 2) के लिए एक स्वीकर्ता के रूप में कार्य करता है।
के तरीके में झल्लाहट रिकॉर्ड करने के लिए
NT "> थोक झल्लाहट मूल्यों चुना अंतर-डाई दूरियों के बीच संबंधों को सत्यापित करने के लिए सबसे उपयुक्त हैं और प्रणाली 2 बाध्यकारी इस TCR-pMHC में मापा क्षमता झल्लाहट। इसके अलावा, थोक झल्लाहट माप अन्तर्ग्रथनी TCR-pMHC समानताएं में गुणात्मक और मात्रात्मक मतभेद (पता चलता है ) के नीचे देख सकते हैं और प्रोटोकॉल अनुभाग 3.2। साहित्य 6 में पेश किया गया है झल्लाहट क्षमता बढ़ाता के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों। इस लेख झल्लाहट के माध्यम से दर्ज की गई है में(क) दाता वसूली स्वीकर्ता विरंजन के बाद, और के माध्यम से
(ख) झल्लाहट स्वीकर्ता उत्सर्जन अवगत।
पहली विधि (क) आसानी से photobleached जा सकता है कि एक झल्लाहट स्वीकर्ता, और नहीं बल्कि photostable है, जो एक दाता के उपयोग की आवश्यकता है। इसके अलावा यह photobleached स्वीकर्ता नहीं रह दाता प्रतिदीप्ति शमन करने में सक्षम है कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक ही पहचान चैनल (दाता) मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जाता है, कोई सुधार एक कारकD नहीं रंगीन aberrations इस पद्धति सरल और विश्वसनीय दान करता है जो विचार किया जाना है। हालांकि, मात्रात्मक मापन एक ही नमूना मौके पर ही दोहराया नहीं जा सकता और झल्लाहट में परिवर्तन समय के साथ दर्ज नहीं किया जा सकता है। (स्वीकर्ता विरंजन से पहले) पहली झल्लाहट दाता और (झल्लाहट स्वीकर्ता विरंजन के बाद) दूसरे झल्लाहट दाता छवि अधिग्रहण के बीच गुजरते समय को कम करता है जो आणविक प्रसार या एक तेजी से विरंजन कदम के लिए उद्देश्य से किया जाना चाहिए सेलुलर गतिशीलता, की वजह से प्रभाव से बचने के लिए। यह रोशनी और विरंजन बार कम करने के क्रम में झल्लाहट स्वीकर्ता उत्तेजना तरंग का एक शक्तिशाली लेजर प्रकाश स्रोत को रोजगार के लिए सलाह देते हैं।
इसके विपरीत, (ख) अवगत झल्लाहट उत्सर्जन माप के दृष्टिकोण में झल्लाहट दाता उत्साहित है और झल्लाहट स्वीकर्ता के उत्सर्जन झल्लाहट स्वीकर्ता चैनल में मनाया जाता है। झल्लाहट स्वीकर्ता संकेत में परिवर्तन लाल स्थानांतरित स्वीकर्ता चैनल में समय है, लेकिन झल्लाहट दाता के उत्सर्जन से अधिक दर्ज किया जा सकता (टीermed bleedthrough) और सही ढंग से निर्धारित होता है और दर्ज की झल्लाहट स्वीकर्ता चैनल से घटाया जाना है दाता उत्तेजना के माध्यम से स्वीकर्ता पार उत्तेजना झल्लाहट। इसके लिए झल्लाहट दाता इसी और झल्लाहट स्वीकर्ता छवियों स्थानिक गठबंधन किया जाना है।
एक अणु का पता लगाने (एस) की घटनाओं झल्लाहट
उत्तेजना स्रोत, एक संवेदनशील कैमरे और शोर-तनु TIRF माइक्रोस्कोपी के रूप में लेज़रों के उपयोग के साथ एकल fluorophores के प्रतिदीप्ति आसानी से समय अधिक का पता लगाया जा सकता है। इसी अंतरआणविक smFRET घटनाओं का पता लगाने के लिए सच है। हालांकि, जटिलताओं झल्लाहट दाता bleedthrough और झल्लाहट स्वीकर्ता के पार उत्तेजना की वजह से है, और इस महान देखभाल smFRET प्रयोग में fluorophore घनत्व जब समायोजन लिया जाना है हो सकता है।
नीचे प्रदान प्रोटोकॉल (प्रोटोकॉल धारा 4) में TCR कम बहुतायत में झल्लाहट स्वीकर्ता के रूप में उच्च बहुतायत और pMHC में झल्लाहट दाता के रूप में चुना गया था। एफआर attenuate करने के लिएपर्याप्त रूप से, फ्लोरोसेंट एससीएफ वी और गैर फ्लोरोसेंट एससीएफ वी के साथ TCRs के 90-70% के साथ TCRs के 10-30% सजाने bleedthrough एट दाता। यह एक अणु के साथ confocal चैनल झल्लाहट है क्योंकि यहाँ झल्लाहट स्वीकर्ता चैनल एक अणु चैनल के रूप में चुना गया था। इस smFRET सत्यापन का आधार है जो झल्लाहट स्वीकार अणु, साथ smFRET घटनाओं के लिए पंक्ति में मदद करता है।
SmFRET माप के माध्यम से अन्तर्ग्रथनी ऑफ दरों निकालने
दोनों की photobleaching दाता झल्लाहट और स्वीकर्ता एक अणु से बातचीत निशान झल्लाहट के आधे जीवन निकालने जब के लिए जिम्मेदार होने की जरूरत झल्लाहट। एकल दाता स्वीकर्ता जोड़ी के रूप में उनकी उपस्थिति एन की शुरुआत में नमूदार झल्लाहट संकेतों की संख्या (0) रिसेप्टर ligand जटिल और photobleaching के दोनों unbinding द्वारा समय पर कम हो जाता है। इस प्रकार के रूप में एक निश्चित समय एन (टी) में परिसरों जीवित रहने की संख्या गणितीय व्यक्त किया जा सकता है:
<p clasएस = "jove_content">Photobleaching अवधि EXP (आयकर / τ ब्लीच) में समय टी यानी, विरंजन ही रोशनी के दौरान होता है टिप्पणियों की संख्या n के उत्पाद और (क्योंकि गैर निरंतर, असतत अवलोकन मोड के बीमार रोशनी समय टी द्वारा वर्णित है )। गतिज अवधि exp- (टी / τ बंद) समय टी टिप्पणियों की संख्या n के उत्पाद है और एक भी झल्लाहट अवलोकन (यानी, गतिज unbinding लगातार होता है) के लिए समय टी अंतराल है भीतर। 1 समीकरण के रूप में व्यक्त किया जा सकता है:
अवधि τ ब्लीच / τ बीमार desविरंजन होता है और उम्मीद मूल्य <n ब्लीच> के रूप में अपनी घातीय समारोह का परिभाषित किया गया है, जब तक टिप्पणियों की संख्या cribes। इस प्रकार के रूप 2 समीकरण को सरल बनाया जा सकता है:
समय टी के बाद नमूदार झल्लाहट घटनाओं के साथ फ्रेम की संख्या एन (टी) की उम्मीद के मूल्य <n (टी अंतराल)> सीधे प्रयोग से निर्धारित होता है। यह प्रयोग में चुना टिप्पणियों (टी अंतराल) और τ बंद (कश्मीर बंद ऑफ दर का उल्टा) के लिए अज्ञात मूल्यों के बीच settable समय पर निर्भर करता है और विरंजन के होने से पहले, टिप्पणियों की संख्या की उम्मीद मूल्य <n ब्लीच> ।
इस प्रकार, टी के कम से कम दो मूल्यों के लिए उम्मीद मूल्य <n (टी अंतराल)> की गणना <sub> अंतराल <n ब्लीच> और बंद τ की प्रयोगात्मक निर्धारण की अनुमति देता।
झल्लाहट आधारित माप के माध्यम से अन्तर्ग्रथनी 2 डी-कश्मीर डी मूल्यों निकालने
TCR अधिभोग यानी एक, बंधे TCRs और कुल TCRs के बीच अनुपात को मापने, अन्तर्ग्रथनी 2 डी-कश्मीर डी मूल्यों को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। के रूप में लंबे समय TCRs झल्लाहट दाताओं और pMHCs झल्लाहट स्वीकार के रूप में के रूप में कार्य करता है के रूप उपज झल्लाहट मापा करने के लिए समीकरण 4 के अनुसार इस अवधि सीधे आनुपातिक है।
एक = TCR अधिभोग के साथ, सी = रूपांतरण कारक
सी झल्लाहट सिस्टम पर निर्भर करता है और fluorophores के लिए प्रयोग किया जाता है, जो एक स्थिर है। नीचे दिखाया गया के रूप में यह प्रयोगात्मक निर्धारित किया जा सकता है। एक समीकरण 5 के अनुसार एक 2 डी-कश्मीर डी में परिवर्तित किया जा सकता है जबपूर्व के दो परतों का निर्माण करने के लिए टी-कोशिकाओं के अलावा करने के लिए TCR ligands के प्रारंभिक घनत्व में जाना जाता है। इस वजह से SLB संलग्न प्रोटीन की उच्च गतिशीलता की है और यह भी SLBs ligands 2 के एक लगभग अटूट जलाशय प्रदान करते हैं।
[pMHC प्रारंभिक] से पहले टी कोशिकाओं के अलावा pMHC की प्रारंभिक घनत्व = के साथ
समीकरणों के साथ 4 और 5 एक अब आसानी से TCR और pMHC बीच synaptic 2 डी-कश्मीर डी निर्धारित कर सकते हैं। यह सबसे मज़बूती स्वीकर्ता विरंजन (प्रोटोकॉल धारा 3.1 देखें) के बाद दाता वसूली के आधार पर झल्लाहट माप के साथ किया जाता है।
हालांकि, सी मैं झल्लाहट झल्लाहट तीव्रता के बीच के रिश्ते को मापने के लिए और TCR अधिभोग एक निर्धारित किया गया है (पृष्ठभूमि के लिए सही, झल्लाहट दाता bleedthrough और स्वीकर्ता पार उत्तेजना झल्लाहट)। इस के लिए, एकमैं दाता झल्लाहट और एक अणु की औसत तीव्रता घटनाओं मैं झल्लाहट एस.एम. झल्लाहट एकल TCR जुड़े झल्लाहट दाता fluorophores (जैसे Cy3 या AF555) एस.एम. की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता के बीच का अनुपात आर पता करने की जरूरत है। आर प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया सवाल, उत्सर्जन फिल्टर और कैमरे में झल्लाहट सिस्टम पर निर्भर करता है।
TCR एक तो सीधे समीकरण 6 के अनुसार निर्धारित किया जा सकता अधिभोग।
आर = एस.एम. के साथ मैं मैं झल्लाहट दाता / एसएम झल्लाहट
आर की ओर जाता है H57 scFv- Cy3 / pMHC-Cy5 प्रणाली के लिए 1.45 के रूप में निर्धारित किया गया था:
एक = थोक मैं 1.45 • / थोक मैं TCR-cy3 झल्लाहट
TCR अधिभोग एक और झल्लाहट उपज के बीच के रिश्ते झल्लाहट दाता द्वारा निर्धारित किया जा सकता की वसूलीस्वीकर्ता विरंजन के बाद वाई। रेखीय फिट की चित्रा -4 ए व्याप्ति ढाल के रूप में दिखाया यह दोनों मानकों एक नंबर TCR microclusters के लिए एक दूसरे के खिलाफ साजिश रची है के लिए (समीकरण 4) रूपांतरण कारक सी इंगित करता है।
1.995 के लिए Cy3 / pMHC-Cy5 झल्लाहट प्रणाली और (ख) लागू माइक्रोस्कोप प्रणाली विन्यास – चित्रा -4 ए में प्रदर्शन किया, सी (एक) H57 एससीएफ V के लिए बराबर है। TCR प्रकार के रूप में एक आसानी से deduced किया जा सकता अधिभोग:
TCR अधिभोग एक = 1.995 • उपज झल्लाहट
बगल में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत मापने ऐसे TCR-pMHC 11 बंधन के रूप में कम आत्मीयता बातचीत के साथ काम कर रहे हैं, खासकर जब अति आवश्यक है। पर-दर के साथ-साथ ऐसी बातचीत की स्थिरता काफी बाध्यकारी जगह लेता है, जिसके तहत विशेष परिस्थितियों से प्रभावित हैं क्योंकि यह है। न्यूनतम इनवेसिव झल्लाहट आधारित इमेजिंग दृष्टिकोण पूरी तरह से इस तरह के कार्यों के लिए अनुकूल सिद्धांत रूप में इस प्रकार हैं, फिर भी पहले दूर किया जाना चाहिए कि बाधाओं के एक नंबर शामिल है। सेलुलर autofluorescence द्वारा उत्पन्न शोर माप की संवेदनशीलता को सीमित करता है और इसलिए कम से कम रखा जाना चाहिए। TIRF माइक्रोस्कोपी आदर्श चुनाव 13-15 के प्रोटीन के साथ सजाया एक तलीय गिलास समर्थित लिपिड bilayer के रूप में बहुत अच्छी तरह से 12 इस जरूरत कार्य करता है, लेकिन कांच के रूप में स्लाइड के functionalization की आवश्यकता है। एक आंशिक रूप से reconstitutive दृष्टिकोण का एक और लाभ पुनः संयोजक बाईलेयर निवासी झल्लाहट भागीदारों के बहुत मीटर हो सकता हैआसानी से छोटे और उज्जवल fluorophores के साथ एक मात्रात्मक, साइट विशेष और तर्कसंगत तरीके से लेबल अयस्क कोशिका की सतह व्यक्त प्रोटीन के साथ संभव होगा की तुलना में। पहले 2 परीक्षण किया गया था के रूप में TCRs, पुनः संयोजक एस सी एफ वी एस, टी-सेल मान्यता को प्रभावित नहीं करते हैं, जिसके साथ टैग कर रहे हैं। इसके अलावा, SLB की प्रोटीन संरचना, उदाहरण के लिए pMHCs के घनत्व और गौण कारकों के चुनाव से एक की विशिष्ट जरूरतों को समायोजित किया जा सकता है। हम पहले उत्तेजक pMHCs के घनत्व के साथ अलग प्रयोगों का प्रदर्शन किया है, लेकिन बंद 2 डी-कश्मीर और 2 डी-कश्मीर डी 2 में काफी अंतर का पता नहीं है।
अब तक यहां MHC वर्ग द्वितीय अणुओं की मान्यता, जिसका मुख्य कारण दोनों सिरों पर खुला है, जो उनके पेप्टाइड बाइंडिंग फांक, की प्रकृति के कारण, केवल के साथ पेश किया गया है और इस तरह की fluorophore कुर्की के लिए एक संयोजक सहित बड़े पेप्टाइड्स रह सकते हैं। कुछ मामलों में इस तरह के दृष्टिकोण को भी लेबलिंग एमएचसी सीएलए के लिए काम हो सकता हैएसएस मैं 16 अणुओं लेकिन बड़ी सावधानी के प्रयोगों में उनके उपयोग को सत्यापित करने के लिए लिया जाना चाहिए। सतह plasmon अनुनाद द्वारा इन विट्रो में मापा के रूप में टी सेल प्रसार assays के लिए, साथ ही कैनेटीक्स बाध्यकारी pMHC-TCR के माध्यम से मापा जा सकता है, जो एंटीजन की ओर टी-कोशिकाओं की संवेदनशीलता लिंकर और फ्लोरोफोरे के के अलावा द्वारा प्रभावित नहीं होना चाहिए पेप्टाइड। वैकल्पिक रूप से, मैं खुद को अणुओं MHC वर्ग भारी श्रृंखला (अप्रकाशित टिप्पणियों) के अनुक्रम में एक unpaired सिस्टीन की शुरूआत के साथ एक साइट विशेष ढंग से लेबल किया जा सकता है।
उचित आणविक जांच के उपयोग के साथ किसी भी synaptic प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत सिद्धांत रूप में वर्णित एक फैशन में अध्ययन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए इस तरह की जांच, एससीएफ वी एस या डिजाइन Ankyrin दोहराएँ प्रोटीन (DARPins) 17, मोनोवैलेन्ट होना चाहिए और ब्याज की बातचीत को प्रभावित किए बिना स्थिरतापूर्वक अपने लक्ष्य के लिए बाध्य करना चाहिए। बेशक, संरचनात्मक informatioएन तर्कसंगत जांच डिजाइन के लिए उच्च वांछनीय नहीं बल्कि बिल्कुल आवश्यक है। झल्लाहट में भागीदारों की एक नई जोड़ी की स्थापना करते हैं, यह रिकॉर्ड और पहले थोक में झल्लाहट का विश्लेषण करने के लिए सिफारिश की है। लेबल लगाव की साइटें संकेत झल्लाहट को अधिकतम करने के लिए काफी अलग किया जा सकता है और यह भी झल्लाहट मापा पैदावार अंतर-डाई दूरी के आधार पर अलग है कि सत्यापित करने के लिए। सिस्टम अनुकूलित है एक बार, एक अणु संकेतों 10-30% करने के लिए उच्च बहुतायत झल्लाहट साथी की लेबलिंग को सीमित करने और एकल अणुओं रोशनी के क्षेत्र में ढूढने हैं जब तक कम बहुतायत झल्लाहट साथी विरंजन द्वारा दर्ज किया जा सकता है झल्लाहट।
पिछले नहीं बल्कि कम से कम यह SLBs कुछ अनुमानित कि ध्यान दिया जाना चाहिए, लेकिन नहीं एक शारीरिक प्लाज्मा झिल्ली के सभी पहलुओं। ऐसी झिल्ली वक्रता और लचीलापन, डोमेन compartmentalization, cytoskeletal rearrangements और सेल गतिशीलता के साथ ही सतह व्यक्त झिल्ली प्रोटीन की एक उच्च किस्म के रूप में गुणों SLBs द्वारा प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे हैं, लेकिन टी प्रभावित हो सकता हैवह जांच के तहत प्रक्रिया। बहुत प्रयास TIRF इमेजिंग के लिए दुर्गम हैं जो शारीरिक synapses में एक अणु संकल्प के साथ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की निगरानी की अनुमति है कि इमेजिंग तौर तरीकों की स्थापना का निवेश करने की आवश्यकता होगी।
The authors have nothing to disclose.
एमए वित्तीय और प्रशासनिक सहायता के लिए ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (FWF, J3086-B11) और धन्यवाद का एक Schrödinger फैलोशिप मैक्स प्लैंक-सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया। जी एस और झा वियना विज्ञान और प्रौद्योगिकी कोष (WWTF, LS13-030) द्वारा समर्थित थे।
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Sf900 II | Life Technologies | 10227402 | insect cell media for baculo virus production |
Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza) | Fisher Scientific | 10564038 | insect cell media for baculo virus expression |
Sf9 cells | Life Technologies | 11496-015 | cells for virus production and expansion |
High Five Cells | Life Technologies | B855-02 | cells for potein expression |
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Centramate System | Pall | protein concentartion from large volumes | |
Centramate cassette 10kDa cutoff | Pall | OS010T12 | protein concentartion from large volumes |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC900308 | protein concentartion |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC800308 | protein concentartion |
Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL | EMD Millipore | 5123 | protein concentartion |
Äkta pure 25L | GE Healthcare | 29-0182-24 | protein purification |
Superdex 200 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5175-01 | protein purification |
Superdex 75 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5174-01 | protein purification |
Mono Q 5/50GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | protein purification |
Ni Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-01 | protein purification |
Tricorn 10/20 column | GE Healthcare | 28-4064-13 | protein purification |
Gilson HPLC system | Gilson | purificationof fluorochrome-coupled peptides | |
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Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size | Agilent | A6000050G212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
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Cy3 maleimide | GE Healthcare | PA23031 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Cy5 maleimide | GE Healthcare | PA25031 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20347 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
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dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 151874 | for dissolving fura-2 am |
Hank's Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium | Fisher Scientific | 10225362 | imaging buffer |
PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
Bovine Serum Albumin lyophilized powder | Sigma Aldrich | A2153 | supplement for imaging buffer |
14-4-4S antibody | affimetrix eBioscience | 14-5980-81 | blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR) |
5 ml polypropylene round-bottom tube | Becton Dickinson | FALCON 352063 | |
0.22 μm Ultrafree-MC centrifugal filter unit | EMD Millipore | UFC30GV0S | |
Syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Life technologies | T-7279 | |
Microscope for fura-2-based calcium measurements | LEICA | DMI4000B | |
Microscope for (single molecule) FRET measurements | LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | |
planar supported lipid bilayers | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | ||
RPMI 1640, with L-Glutamine | Life Technologies | 11554416 | T-cell media |
non-essential amino acid 100X | Hyclone | SH30238.01 | T-cell media supplement |
penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x | Life Technologies | 12000226 | T-cell media supplement |
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | T-cell media supplement |
mouse interleukin-2 recombinant protein | BPS Bioscience | 90185-B | T-cell media supplement |
Research Grade Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | T-cell media supplement |
Origin (analysis program) | OrigenLab | http://www.originlab.com/ | non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag]) |