Mittels konfokaler Analyse<em> Xenopus laevis</em> Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen
Summary
Das Manuskript hier bietet eine einfache Reihe von Methoden für die Sekretion und Verbreitung von fluoreszierend markierten Liganden in Xenopus-Analyse. Dies bietet einen Rahmen für die Prüfung der Fähigkeit von anderen Proteinen zu Ligand Verteilung ändern und erlaubt Experimente, die Einblick in die Mechanismen, die Morphogen Gradienten geben kann.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um Liganden über ein Feld von Zellen verteilt visualisieren. Die Leichtigkeit der exprimieren exogene Proteine, zusammen mit der Größe ihrer Zellen in frühen Embryonen, stellen Xenopus laevis ein nützliches Modell für die Visualisierung von GFP-markierten Liganden. Synthetischer mRNAs effizient nach der Injektion in die übersetzte frühzeitig Xenopus-Embryonen und Injektionen können auf eine einzelne Zelle gezielt werden. Wenn sie mit einer Linie Tracer wie Membranbunden RFP kombiniert werden, kann der eingespritzte Zelle (und ihre Nachkommen), die Herstellung des überexprimierten Proteins leicht verfolgt werden. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von fluoreszenzmarkierten Wnt und Shh Liganden aus injizierten mRNA. Die Verfahren die micro Dissektion der ektodermalen Explantate (animal caps) und der Analyse der Liganden Diffusion in mehreren Proben. Durch konfokale Bildgebung können Informationen über Ligand Sekretion und Diffusion über ein Feld von Zellen erhalten werden. Statistische Analysen der konfokalen Bilder liefern quantitative Daten über die Form des Liganden Steigungen. Diese Methoden können nützlich für Forscher, um die Auswirkungen der Faktoren, die die Form der Morphogen Gradienten regulieren kann testen wollen.
Introduction
Während der frühen embryonalen Entwicklung werden die Zellen schrittweise verpflichtet, bestimmte Abstammungslinien der Differenzierung zu folgen: dies bedeutet eine Gruppe von totipotenten (oder pluripotenten Zellen) werden auf die Schaffung Populationen von Vorläuferzellen bestimmt Anlass zu einem Zelltyp geben allmählich beschränkt. Zell-Zell-Signalisierung ist von zentraler Bedeutung für die Regulierung der Linienspezifikation während der embryonalen Entwicklung. Manipulation dieser Signale wird benötigt, um Stammzellen in Richtung besonderen Schicksale lenken, neue medizinische Behandlungen zu unterstützen.
Eine relativ kleine Anzahl von Signalwegen, werden während der Entwicklung wiederholt, einschließlich Wegen als Antwort auf die TGF-Superfamilie (nodals und BMPs) 1-2, FGFs 3, Wnt 4 und 5 Igel. Diese sekretierten Proteine binden an der Zellmembran, die Signaltransduktion wodurch Genexpression und / oder das Verhalten der Zelle ändern aktivieren Rezeptoren. Die enge Regulation von ZellzeichenAlling ist essentiell für Zelllinie Spezifikation und eine normale Entwicklung. Während das Übersprechen zwischen diesen Bahnen ist bei der Bestimmung des Zellschicksals wichtig ist, kann ein einzelner Ligand selbst hervorrufen unterschiedliche Reaktionen in unterschiedlichen Konzentrationen. Morphogen Gradienten wurden vor über 100 Jahren als eine Theorie zu erklären, wie verschiedene Zelltypen können aus einem Feld von Zellen 6 abzuleiten beschrieben. Signalmoleküle durch eine Gruppe von Zellen hergestellt werden, können über einen gewissen Bereich zu diffundieren, Abnahme in der Konzentration mit einem größeren Abstand von der Quelle. Zellen auf das Signal ausgesetzt wird, um die lokale Konzentration an ihrer Position in dem Bereich der Zellen entsprechen, die sich Zellen an verschiedenen Positionen unterschiedlich reagieren auf verschiedenen Ebenen des Signals. Beweise für die Existenz von Morphogenen ergeben sich aus Studien der frühen Drosophila-Embryo 7 und der Flügelscheibe 8 sowie des Vertebraten Schenkel 9 und Neuralrohr 10.
Verfahren sind in benötigtenvestigate wie Morphogen Gradienten etabliert sind und an andere Moleküle bei der Regulierung dieser Gradienten wichtig zu identifizieren. Elegante Experimente mittels Immunhistochemie auf endogenen Proteinen in vivo im Kontext von verschiedenen genetischen Hinter visualisiert wurden zur Morphogengradienten 11-12 untersuchen. , Gute Antikörpern und spezifischen Mutanten sind jedoch nicht immer zur Verfügung, so dass wir mit Überexpression von fluoreszierenden Liganden in Xenopus, um eine alternative, einfache Methode, um zu zerlegen, wie exogene Genprodukte Verteilung von Liganden, die über ein Feld von Zellen beeinflussen, bereitzustellen beschreiben hier eine Protokoll. Xenopus laevis bietet ein ausgezeichnetes System, um diese Arten von Experimenten durchzuführen, wie ihre Embryonen entwickeln, von außen, so dass sie in den frühesten Stadien zugänglich sind. Ihre Größe (1-1.5mm Durchmesser) vereinfacht die Mikroinjektion und chirurgischen Manipulation und durch Blastula Stufen die Zellen leicht zu Bild, da sie immer noch relativ groß ist (etwa 2081; m Durchmesser). Die Überexpression Studien in Xenopus sind einfach zu tun: mRNA in den frühen Embryo injiziert werden, um bestimmte Zellen gezielt und effizient umgerechnet.
Die fluoreszenzmarkierten Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP-Konstrukte wurden mit pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 und eGFP generiert. Der HA-Peptid ist wichtig, umfassen nicht nur eine zusätzliche molekulare Markierung zu schaffen, sondern auch, weil es wird angenommen, dass als Abstandshalter trennt die Wnt und eGFP-Proteinen so dass sowohl Genprodukte zu funktionieren handeln. Das zur Visualisierung von Shh verwendet Konstrukt wurde zuvor verwendet, um eine transgene Maus eine Shh-eGFP-Fusionsproteins 15 exprimieren, zu erzeugen; Dies wurde freundlicherweise von Andy McMahon zur Verfügung gestellt. Wichtig ist, dass das GFP-Tag für alle Konstrukte kloniert 3 'zur Signalsequenz, so daß sie nach der Bearbeitung beibehalten. Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass die endgültige Protein enthält Sequenzen, die für Änderungen erforderlich sind, wie die addition von Lipiden, wie es der Fall für Shh und Wnt ligands.The cDNAs wurden in den pCS2 + Expressionsvektor, der für die prodution synthetischer mRNA optimiert ist subkloniert; es enthält einen SP6-Promotor und Polyadenylierungssignal (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).
Die hier beschriebene Arbeit bietet ein einfaches Protokoll für den Vergleich der Sekretion und Verbreitung von fluoreszenzmarkierten Wnt und Shh getaggt Liganden. Durch Einspritzen von definierten Mengen synthetischer mRNA, umrundet das Protokoll keine Probleme mit variabler Expression aus verschiedenen Vektoren mit verschiedenen Promotoren verbunden. Diese Methoden wurden kürzlich angewendet, um die Wirkungen von Heparansulfat endosulfatase Sulf1 auf Shh-eGFP und Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP-Sekretion und Diffusion in Xenopus 16-17 untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein wesentlicher Teil dieses Protokolls erzeugt biologisch aktiven Liganden, die normalerweise bearbeitet werden, ausgeschieden wird, und fähig sind, eine Antwort in der Aufnahmezelle auslösen kann, obwohl sie eine fluoreszierende Gruppe gebunden. Es kritisch ist, nachzuweisen, dass das fluoreszenzmarkierte Genprodukt ist biologisch aktiv unter Verwendung eines geeigneten Assays. Für Shh-GFP wurde die Fähigkeit, die Expression von ptc1 aktivieren 16 bestätigt. Wnt8a hat eine bemerkenswert starke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von einem BBSRC finanziert gewähren MdEP (BB / H010297 / 1), ein BBSRC Quoten studentship zu SAR und einen MRC studentship zu SWF.
Materials
| Agarose | Melford | MB 1200 | |
| Ammonium acetate | Ambion | From Megascript SP6 Kit AM 1330 | |
| Bicarbonate | VWR International | RC-091 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C13961 | |
| Cap analog (m7G(5')) | Applied Biosystems | AM 8050 | |
| Chloroform | Sigma | C 2432 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427-013 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | O3690 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.33 | |
| Ficoll 400 | Sigma | F 4375 | |
| Fiji image J software | N/A | N/A | Free download http://fiji.sc/Fiji |
| Gentamycin | Melford | G 0124 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A/0400/PB17 | |
| Glass cover slips, No.1.5 | Scientific Laboratory Supplies | 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 | |
| Glass needle puller | Narishige | Narishige PC -10 | |
| Glass pull needles | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Human chronic gonadotropin (HCG) | Intervet | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | P/7500/PB17 | |
| Lithium chloride (LiCl) | Sigma | L-7026 | |
| LSM710 and Zen software (2008-2010) | Carl Zeiss | ||
| Matlab software | Mathworks | http://uk.mathworks.com/ | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP 2819-10 | |
| Nail varnish | Boots | Bar code 3600530 373048 | |
| Spectrophotometer | Lab.tech International | ND-1000 / ND8000 | |
| Petri dish (55mm) | VWR International | 391-0865 | |
| Phenol-chloroform | Sigma | P3803 | |
| Photoshop software | Adobe | N/A | http://www.photoshop.com/products |
| High fidelity DNA polymerase and buffers | Biolabs | M0530S Buffer – M0531S | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
| PVC insulation tape | Onecall | SH5006MPK | |
| Gel extraction kit | Qiagen | S28704 | |
| Restriction enzymes buffers | Roche | SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001 | |
| RNAse-free DNAse | Promega | ME10A | |
| Steel back single edge blades | Personna | 66-0403-0000 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 27810.364 | |
| SP6 transcription kit | Ambion | AM1330 | |
| Glass slides | Thermo Fisher | SHE 2505 | |
| Tris base | Invitrogen | 15504-020 | |
| Tungsten needles | N/A | N/A | homemade |
| Zen lite software | Carl Zeiss | N/A | Free download http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html |
References
- Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
- Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
- Pownall, M. E., Isaacs, H. V. . FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, 1-75 (2010).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
- Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
- Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
- Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
- Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
- Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
- Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
- Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
- Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
- Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. 발생학. 320 (2), 436-445 (2008).
- Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. 발생학. 391 (2), 207-218 (2014).
- Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics : A biologist’s guide. , (2005).
- Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
- Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
- Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
- Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
- Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
- McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
- Schohl, A., Fagotto, F. B. e. t. a. -. c. a. t. e. n. i. n. MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
- Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
- Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2010).
