High-throughput screening af Modstridigheden Variationer i lignocelluloseholdige biomasse: Total Lignin lignin Monomerer og enzymatisk Sugar Frigivelse

Summary

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Abstract

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Introduction

Som det globale udbud af ikke-vedvarende brændstoffer og deres tilhørende produkter falder, har forskerne blevet udfordret til at skabe lignende brændstoffer og kemikalier fra plante-afledte kilder ^1. Et centralt aspekt af dette arbejde er at bestemme hvilke arter af planter kan være egnet til produktion af biobrændstoffer og biomaterialer ^2,3. Typisk er disse råmaterialer evalueret for lignin, cellulose, hemicellulose og indhold; samt deres tilbøjelighed til dekonstruktion (Modstridigheden) ved termisk, mekanisk og / eller kemisk forbehandling med eller uden efterfølgende enzym forsukring. Mere detaljerede analyser anvendes til at bestemme den specifikke sammensætning af lignin og hemicellulose fraktioner samt optimale enzymaktiviteter behov. Transgene modifikationer af planter, der ikke i sig selv besidder ideelle træk for biokemisk eller termokemisk omdannelse til ønskede råvarer har givet forskere med en stærkt udvidet kilde til potrentielle råmaterialer ^4. Faste analysemetoder til kvantificering af kemiske træk af en plante, mens ganske nyttigt for små prøvesæt, er uegnede til hurtig screening af hundreder eller tusinder af prøver ^5-7. Der er blevet udviklet HTP heri beskrevne fremgangsmåder til hurtigt og effektivt at vurdere et stort antal af biomasse varianter for ændringer i cellevæggen Modstridigheden til termokemisk og / eller enzymatisk nedbrydning.

Det er afgørende at forstå, at HTP screeningsassays beskrevet heri er ikke designet til at maksimere konvertering eller udbytte. Formålet er at bestemme relative forskelle i den intrinsiske Modstridigheden relaterede biomasse prøver. Som et resultat, mange af analyse trin adskiller sig fra de "typiske" biomasse konvertering assays, hvor målet er at opnå maksimal omregningskurs eller omfang. For eksempel er lavere forbehandlingsanlæg sværhedsgrader og kortere enzymhydrolyse gange bruges til at maksimere afvigerner på mellem prøverne. I de fleste tilfælde er relativt høje enzymbelastninger anvendes til at reducere forskelle på grund af eksperimentelle variation i enzymaktivitet, som kunne forvrænge resultaterne betydeligt.

Hurtige teknikker til bestemmelse af sammensætningen af plante celle-vægge og de ​​monomere sukkerarter befriet efter enzymatisk forsukring omfatter robotteknologi, tilpassede, termokemisk kompatible 96 brønde, og ændringer af standard laboratoriemetoder ^8-11 og instrumentale protokoller, såsom vibrations spektroskopi (infrarød (IR), nær-infrarødt (NIR), eller Raman) og nuklear magnetisk resonans (NMR) ^12-17. Disse metoder er nøglen til at isolere råmaterialer med høj cellulose eller lavt indhold lignin, eller dem forventes at give den højeste glukose, xylose, ethanol, etc. Disse metoder har aktiveret nedskaleret analyser, der beskæftiger mindre mængder af biomasse og hjælpematerialer, hvilket fører til reduktioner i eksperimentel udgift ¹⁸ </sop>. Et andet træk ved denne metodiske tilgang er, at forskellige eksperimentelle betingelser kan være hurtigt, og i nogle tilfælde samtidig, evalueres. For eksempel kan en række forskellige strategier forbehandling eller enzym cocktails skal testes, således at de optimale eksperimentelle parametre, der skal hurtigt identificeres og anvendes. Populære råmaterialer, som majsstængler ^9, poppel ^8,10, sukkerrør bagasse ^{8 og} staudehirse ⁸ er blevet evalueret med succes ved hjælp af disse metoder HTP.

Total lignin og lignin monomersammensætning er også almindeligt kvantificeret biomasse træk. Reduktioner i lignin-indhold har vist sig at øge den enzymatiske fordøjelighed af polysaccharider ^19,20. Den rolle, som lignin monomere ratio (ofte rapporteret som syringyl / guaiacyl (S / G) indhold) spiller i dekonstruktion af planten cellevæggen er stadig under efterforskning. Nogle rapporter har indikeret, at reduktioner i S / GForholdet ført til øget glucose udbytter efter hydrolyse ^21, mens andre undersøgelser afsløre den modsatte tendens ^19,22. High throughput metoder til evaluering lignin og dets monomerer indbefatter vibrationelle spektroskopi (IR, NIR og Raman ^23-26) kombineret med multivariat analyse, og pyrolyse molekylær stråle massespektrometri (pyMBMS) ^27,28.

Ved udviklingen HTP metoder til screening af biomasse, har brug for flere integrerede overvejelser skal holdes for øje. Et centralt aspekt er kompleksiteten af ​​metoden. Hvad er det krævede kvalifikationsniveau for teknik? Kemometriske analyser, for eksempel, kræver særlige færdigheder til at konstruere, evaluering, og opretholdelse af prædiktive modeller. De standardmetoder udviser uønskede skridt forberedende eller dataanalyse eller ansætte giftige reagenser. Udvikling af modellerne er en løbende proces, hvor nye data er indarbejdet i modellen over tid at øge modellens robusthed. En anden considbejde er de besparelser og nedsat eksperimentelle analyse tidspunkter af de foreslåede high-throughput metoder. Hvis metoden er ganske hurtig, men meget dyrt, kan det ikke være en gennemførlig teknik til mange laboratorier til at vedtage. Metoderne illustreret i dette manuskript er varianter af standardiserede teknikker, modificeret til at forstærke throughput kapaciteter. Disse protokoller kvantitativt måle biomasse træk af interesse uden nødvendiggør udviklingen af ​​prognosemodeller. Dette er et centralt egenskab ved disse teknikker, da prædiktive metoder, mens udstiller stærke korrelationer med den standard analyser bruges til at udvikle modeller, er ikke så nøjagtige som faktisk måle mængden af ​​interesse for prøverne. Hvorimod de anvendte metoder er i det væsentlige skaleret ned versioner af standard analysemetoder bench-skala, handles nøjagtighed og præcision for hastighed og gennemløb. For det meste dette resultat skyldes højere fejl i lille volumen pipettering og vejer; samt øget srigelig heterogenitet som prøve størrelse reduceres. Mens store prøvesæt kan screenes og sammenlignes, skal stor forsigtighed udvises, når de foretager sammenligninger mellem separate kampagner og til bench-skala resultater.

De mest tidskrævende trin involverer den fysiske manipulation af biomassen. Slibning prøver kan tage flere minutter per prøve, herunder rengøring ud møllen mellem prøver. Manuel lastning, losning, og rengøring tragte og fylde og tømme te poser og sække til prøveudtagning er også meget arbejdskrævende. Mens hvert trin kan tage et minut eller mere, kan gøre tusindvis af prøver tage mange timer eller endda dage. Robotterne kan indlæse en typisk reaktor plade med biomasse i omkring 3 til 4 timer eller 6 til 8 plader ^dag -1 robot ^-1. Denne situation afhænger af de parametre, der anvendes præcision samt typen og mængden af ​​biomasse, der skal testes. Påfyldning reaktor plader med vand, fortyndet syre eller enzym hurtigt gøres ved hjælp af en væskehåndtering robot. Pgenbehandling af en plade stack (1 til 20 reaktorer plader) tager mellem 1 og 3 timer, når montering, køle ned, og adskillelse er inkluderet. Enzymhydrolyse tager 3 dage og analysen sukker kræver ca 1 time af prep tid plus 10 min pr reaktor plade til at færdiggøre analysen og læse resultaterne. En ugentlig tidsplan for fastsatte forbehandling og analyse dage rummer en rimelig arbejde tidsplan, minimerer ulige-timers og weekend indsats for den menneskelige del af analysen og giver mulighed for behandling ~ 800 til 1.000 prøver pr uge løbende. Den maksimale kapacitet afhænger af flere faktorer, herunder især hvor meget hardware (robotter, reaktorer plader, etc.), og hvor meget "software" (dvs. bemanding) til at foretage det manuelle arbejde. Den praktiske øvre grænse er 2.500 til 3.000 prøver / uge; imidlertid, at produktionen kræver syv dage om ugen drift og flere studentermedhjælpere og teknikere. Til sammenligning ville 3.000 prøver ved HPLC kræver ca. 125 dage Sample analyse plus ekstra arbejdskraft af manuelt vejer prøver i reaktorer og filtrering prøver inden analyse.

Protocol

1. Højkapacitetsforskning bestemmelse af glucose og xylose Udbytter Efter Enzymatisk Enzymatisk 9,29 Prøveforberedelse (Slibning, De-stivning, Ekstraktion, Forbehandling) Grind mindst 300 mg af hver prøve ved anvendelse af biomasse en Wiley-mølle, således at partiklerne passerer gennem en 20 mesh (850 um) sigte. Overførsel til anti-statiske zip-top poser (typisk bar-kodet) og optage prøve information til stregkode-databasen. Tilføj ca. 250 mg eller mere af jorden biomasse…

Representative Results

Den kombinerede virkning af termokemiske forbehandling og efterfølgende enzym forsukring måles som en funktion af massen af ​​glucose og xylose der frigives ved afslutningen af ​​assayet. Resultaterne er rapporteret i form af milligram glucose og xylose der frigives per gram biomasse. Dette er i skarp kontrast til data rapporteret fra bench-skala assays, der normalt rapporteres som procent teoretiske udbytte baseret på analyse af sammensætningen af ​​udgangsmaterialet. Da det endnu ikke er praktisk at ud…

Discussion

De vigtigste prøveforberedelse trin til opnåelse af nøjagtige og reproducerbare data ved udførelse af high-throughput screening eksperimenter er som følger:

Sugar frigivelsesassay:

I almindelighed prøver fremstillet i partier, der spænder fra nogle få dusin til flere tusinde ad gangen. Hvert stort skridt udføres typisk for alle prøver før bevæger sig fremad for at minimere variationer i forberedelse mellem prøver. De-Stivelse var ikke oprindeligt en …

Materials

Wiley mill	Thomas Scientific	3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill)
anti-static bags	Minigrip*	MGST4P02503	2.5×3", multiple suppliers available
tin-coated copper wire	McMaster-Carr	8871K84	0.016" diameter, bend-and-stay wire
tea-bags	Herbco	press n' brew teabags	3.5×5 inches
gluco-amylase	Novozymes	Spirizyme Fuel
alpha-amylase	Novozymes	Liquozyme SC DS
sodium acetate trihydrate	any chemical supplier		reagent grade
acetic acid	any chemical supplier		reagent grade
190 proof (95%) ethanol	any chemical supplier		reagent grade
hoppers	Freeslate
96-well C-276 Hastelloy plates	Aspen Machining (Lafayette, Colorado)	N/A (custom built)
1/8” soldering iron tip	Sears
silicone-adhesive backed Teflon tape	3M	5180	3" wide (36-yard rolls)
enzyme solution	Novozymes		Cellic CTec2
citric acid monohydrate	any chemical supplier
trisodium citrate dihydrate	any chemical supplier
disposable, polystyrene 96-well plates	Greiner Bio-One	655101	or equivalent; multiple suppliers available
glucose oxidase/peroxidase	Megazyme	K-Gluc	Megazyme D-glucose assay kit
xylose dehydrogenase	Megazyme	K-Xylose	Megazyme D-xylose assay kit
glucose standard solution	Megazyme	K-Gluc	Megazyme D-glucose assay kit
xylose standard solution	Megazyme	K-Xylose	Megazyme D-xylose assay kit
stainless steel sample cups	Frontier Laboratories	PY1-EC80F
glass fiber sheets	Pall	66227	8×10" sheets–circles punched with standard hole punch
Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock	NIST	8491
Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock	NIST	8492
Monterey Pine Whole Biomass Feedstock	NIST	8493
Wheat Straw Whole Biomass Feedstock	NIST	8494