High-throughput screening van weerspannigheid Variaties in lignocellulose: Total Lignine, Lignine monomeren, en enzymatische Sugar release

Summary

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Abstract

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Introduction

Als de wereldwijde levering van niet-hernieuwbare brandstoffen en bijbehorende producten afneemt, hebben wetenschappers uitgedaagd om soortgelijke brandstoffen en chemicaliën maken op basis van plantaardige bronnen ^1. Een belangrijk aspect van dit werk is bepalen welke soorten planten geschikt voor de productie van biobrandstoffen en biomaterialen ^2,3 zijn. Meestal worden deze voedingen geëvalueerd lignine, cellulose en hemicellulose inhoud; evenals hun gevoeligheid voor deconstructie (weerbarstigheid) door middel van thermische, mechanische en / of chemische voorbehandeling met of zonder daaropvolgende enzym versuikering. Meer gedetailleerde analyses worden gebruikt om de specifieke samenstelling van de lignine en hemicellulose fracties en een optimale enzymactiviteit noodzakelijk te bepalen. Transgene modificaties van planten die niet intrinsiek bezitten ideale eigenschappen voor biochemische en thermochemische conversie naar gewenste grondstoffen hebben de onderzoekers voorzien van een zeer uitgebreide bron van de pottiële grondstoffen ^4. De standaard analytische methoden voor het kwantificeren van de chemische eigenschappen van de plant, terwijl zeer bruikbaar voor kleine sample sets, ongeschikt voor het snel screenen van honderden of duizenden monsters ^5-7. De HTP hierin beschreven werkwijzen zijn ontwikkeld om grote aantallen varianten biomassa snel en efficiënt te evalueren van veranderingen in celwand weerspannigheid aan thermochemische en / of enzymatische afbraak.

Het is cruciaal om te begrijpen dat de HTP screeningstesten die hierin zijn beschreven zijn niet bedoeld om de conversie of de opbrengst te maximaliseren. Het doel is om relatieve verschillen in de intrinsieke weerbarstigheid verwante biomassa monsters te bepalen. Hierdoor vele analysestappen verschillen van de "typische" biomassa conversie assays, waarbij het doel is om maximale omzetting snelheid of mate te verkrijgen. Zo worden lagere voorbehandeling severities en kortere enzymhydrolyse keer gebruikt maximaliseren afwijkenschillen tussen de monsters. Meestal gaan hoge enzymladingen gebruikt om verschillen als gevolg van experimentele variatie in enzymactiviteit, die de resultaten aanmerkelijk kunnen scheef verminderen.

Snelle technieken waarmee de samenstelling van plantaardige celwanden en de monomere suikers bevrijde volgende enzymatische versuikering omvatten robotics, aangepast, thermochemisch compatible 96-well platen en aanpassingen van standaard laboratoriummethoden ^8-11 en instrumentele protocollen, zoals vibratiespectroscopie (infrarood (IR), nabij-infrarood (NIR), of Raman) en nucleaire magnetische resonantie (NMR) ^12-17. Deze methoden zijn de sleutel tot het isoleren van grondstoffen met een hoog cellulose of lage gehalten lignine, of die naar verwachting de hoogste glucose, xylose, ethanol opleveren, enz. Deze methoden hebben downscaled analyses die kleinere hoeveelheden biomassa en verbruiksgoederen in dienst ingeschakeld, wat leidt tot vermindering van de experimentele kosten ¹⁸ </sup>. Een ander kenmerk van deze methodiek is dat verschillende experimentele omstandigheden snel kunnen worden en in sommige gevallen tegelijk, geëvalueerd. Zo kan een grote verscheidenheid aan voorbehandeling strategieën of enzym cocktails worden beproefd, waardoor de meest optimale experimentele parameters snel worden geïdentificeerd en toegepast. Populaire voedingsmaterialen, zoals maïsstro ^9, populier ^8,10, suikerriet bagasse ⁸ en switchgrass ⁸ zijn succesvol geëvalueerd met behulp van deze werkwijzen HTP.

Totaal lignine en lignine monomeer samenstelling worden ook vaak gekwantificeerd biomassa trekken. Verlagingen van lignine is aangetoond dat de enzymatische verteerbaarheid van polysacchariden ^19,20 te verhogen. De rol die de lignine monomeer verhouding (vaak gerapporteerd als syringyl / guaiacyl (S / G)) speelt in de deconstructie van de plant celwand wordt nog onderzocht. Sommige rapporten hebben aangegeven dat een verlaging van de S / Gverhouding heeft geleid tot een verhoogde glucose opbrengst na hydrolyse ^21, terwijl andere studies onthullen het tegenovergestelde trend ^19,22. High throughput methoden voor het evalueren van lignine en de monomeren zijn vibrationele spectroscopie (IR, NIR, Raman en ^23-26) in combinatie met multivariate analyse, en pyrolyse moleculaire bundel massaspectrometrie (pyMBMS) ^27,28.

Bij de ontwikkeling van HTP methoden voor het screenen van biomassa, moet een aantal integrale overwegingen in het achterhoofd worden gehouden. Een belangrijk aspect is de complexiteit van de werkwijze. Wat is het vereiste niveau voor de techniek? Chemometrische analyses, bijvoorbeeld, vereisen bijzondere vaardigheden voor het construeren, evalueren en onderhouden voorspellende modellen. De standaard methoden vertonen ongewenste stappen voorbereidende of data-analyse of dienst giftige reagentia. De ontwikkeling van de modellen is een continu proces waarbij nieuwe gegevens worden opgenomen in het model in de tijd om de robuustheid van het model te verhogen. Andere considking is de kostenbesparing en verminderde experimentele analyse maal de voorgestelde high-throughput methoden. Als de methode tamelijk snel, maar zeer duur, kan het geen haalbare techniek voor vele laboratoria om aannemen. De werkwijzen toegelicht in dit handschrift varianten gestandaardiseerde technieken, bewerkt om de doorvoersnelheid mogelijkheden amplificeren. Deze protocollen kwantitatief de biomassa eigenschappen van belang te meten zonder de noodzaak van de ontwikkeling van voorspellende modellen. Dit is een belangrijk kenmerk van deze technieken, aangezien voorspellingsmethoden, terwijl met een sterke correlatie met de standaard analyses gebruikt om modellen te ontwikkelen, zijn niet zo nauwkeurig als werkelijk meten van de hoeveelheid van belang voor de monsters. Overwegende dat de gebruikte zijn in wezen verkleinde versies van de standaard bench-schaal analysemethoden methoden, nauwkeurigheid en precisie worden verhandeld voor snelheid en doorvoer. Meestal, dit resultaat is te danken aan hogere fouten in klein volume pipetteren en wegen; alsmede een toename van svoldoende heterogeniteit als monster wordt verkleind. Terwijl de grote sample sets kunnen worden gescreend en vergeleken, moet grote zorgvuldigheid worden betracht bij het maken van vergelijkingen tussen afzonderlijke campagnes en bench-schaal resultaten.

De meest tijdrovende stappen omvatten de fysieke manipulatie van de biomassa. Slijpen monsters kan enkele minuten per monster, met inbegrip van het schoonmaken van de molen tussen de monsters te nemen. Handmatig laden, lossen en schoonmaken hoppers en het vullen en legen van theezakjes en sample zakken is ook zeer arbeidsintensief. Terwijl elke stap een minuut of langer kan duren, kan het doen van duizenden monsters vele uren of zelfs dagen duren. De robot kan een typische reactor geladen plaat biomassa in ongeveer 3 tot 4 uur of 6-8 platen dag ^{-1 -1} robot. Deze situatie is afhankelijk van de nauwkeurigheid parameters, alsmede het type en de hoeveelheid biomassa te testen gebruikt. Vullen reactor platen met water, verdund zuur of enzym wordt snel gedaan met behulp van een liquid handling robot. Pherbehandeling van een stapel platen (1-20 reactor platen) duurt tussen 1 en 3 uur na montage, koelen en demontage inbegrepen. Enzymhydrolyse duurt 3 dagen en de suiker analyse vereist ongeveer 1 uur van prep tijd plus 10 min per reactor plaat om de test te voltooien en lees de resultaten. Een wekelijks schema van set voorbehandeling en analyse dagen herbergt een redelijke werkschema minimaliseren oneven uur weekend inspanningen voor menselijke component van het assay en maakt bewerking ~ 800 tot 1000 samples per week op een permanente basis. De maximale doorvoersnelheid hangt af van verschillende factoren, vooral hoeveel hardware (robots, reactoren platen, enz.) En hoeveel "software" (dwz, personeel) zijn beschikbaar voor de handmatige werk te doen. De praktische bovengrens is 2500 tot 3000 monsters / week; echter, dat de output vereist 7 dagen per week operatie en meerdere stagiaires en technici. In vergelijking zou 3000 monsters met HPLC ongeveer 125 dagen sam vereisenple analyse plus de extra arbeid van de hand met een gewicht van de monsters in de reactoren en filtering monsters voorafgaand aan analyse.

Protocol

1. High-throughput bepaling van glucose en xylose Opbrengsten Na enzymatische versuikering 9,29 Monstervoorbereiding (Malen, De-stijven, Extraction, voorbehandeling) Grind ten minste 300 mg van elk monster biomassa met een Wiley molen, zodat de deeltjes door een 20 mesh (850 urn) scherm. Transfer naar anti-statische zip-top zakken (meestal bar-code) en opnemen monster informatie aan de barcode database. Voeg ongeveer 250 mg of meer van de grond biomassa uit de anti-statische zak …

Representative Results

Het gecombineerde effect van de thermochemische voorbehandeling en daaropvolgende enzym versuikering wordt gemeten als een functie van de massa van glucose en xylose vrijgegeven op het einde van de test. De resultaten worden in termen van mg glucose en xylose vrijkomt per gram biomassa. Dit staat in schril contrast met gerapporteerde gegevens van bench-scale testen die gewoonlijk wordt gerapporteerd als percentage theoretische opbrengst gebaseerd op analyse van de samenstelling van het uitgangsmateriaal. Omdat het nog n…

Discussion

De belangrijkste monstervoorbereiding stappen voor het verkrijgen van nauwkeurige en reproduceerbare gegevens bij het uitvoeren van high-throughput screening experimenten zijn als volgt:

Sugar afgifte test:

In het algemeen worden monsters in partijen variëren van enkele tientallen tot enkele duizenden tegelijk. Elke belangrijke stap wordt gewoonlijk uitgevoerd voor alle monsters vóór vooruit om variaties tussen monsters bereiding te minimaliseren. De-stijven w…

Materials

Wiley mill	Thomas Scientific	3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill)
anti-static bags	Minigrip*	MGST4P02503	2.5×3", multiple suppliers available
tin-coated copper wire	McMaster-Carr	8871K84	0.016" diameter, bend-and-stay wire
tea-bags	Herbco	press n' brew teabags	3.5×5 inches
gluco-amylase	Novozymes	Spirizyme Fuel
alpha-amylase	Novozymes	Liquozyme SC DS
sodium acetate trihydrate	any chemical supplier		reagent grade
acetic acid	any chemical supplier		reagent grade
190 proof (95%) ethanol	any chemical supplier		reagent grade
hoppers	Freeslate
96-well C-276 Hastelloy plates	Aspen Machining (Lafayette, Colorado)	N/A (custom built)
1/8” soldering iron tip	Sears
silicone-adhesive backed Teflon tape	3M	5180	3" wide (36-yard rolls)
enzyme solution	Novozymes		Cellic CTec2
citric acid monohydrate	any chemical supplier
trisodium citrate dihydrate	any chemical supplier
disposable, polystyrene 96-well plates	Greiner Bio-One	655101	or equivalent; multiple suppliers available
glucose oxidase/peroxidase	Megazyme	K-Gluc	Megazyme D-glucose assay kit
xylose dehydrogenase	Megazyme	K-Xylose	Megazyme D-xylose assay kit
glucose standard solution	Megazyme	K-Gluc	Megazyme D-glucose assay kit
xylose standard solution	Megazyme	K-Xylose	Megazyme D-xylose assay kit
stainless steel sample cups	Frontier Laboratories	PY1-EC80F
glass fiber sheets	Pall	66227	8×10" sheets–circles punched with standard hole punch
Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock	NIST	8491
Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock	NIST	8492
Monterey Pine Whole Biomass Feedstock	NIST	8493
Wheat Straw Whole Biomass Feedstock	NIST	8494