High-throughput screening delle Variazioni riluttanza a lignocellulosica Biomassa: Total lignina, lignina monomeri, e enzimatica Zucchero di uscita

Summary

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Abstract

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Introduction

Mentre l'offerta mondiale di combustibili non rinnovabili e loro prodotti associati declino, gli scienziati sono stati messi in discussione per creare carburanti e sostanze chimiche simili da fonti di origine vegetale ^1. Un aspetto chiave di questo lavoro è determinare quali specie di piante possono essere adatti per la produzione di biocarburanti e biomateriali ^2,3. Tipicamente, queste materie prime vengono valutati per la lignina, cellulosa, emicellulosa e contenuti; nonché la loro suscettibilità alla destrutturazione (recalcitrance) attraverso pretrattamento termico, meccanico e / o chimico con o senza successiva saccarificazione enzimatica. Analisi più dettagliate sono utilizzati per determinare la composizione specifica della lignina ed emicellulosa frazioni nonché attività ottimali enzima necessario. Modificazioni transgeniche di piante che non possiedono intrinsecamente caratteristiche ideali per la conversione biochimica o termochimica di merci desiderati hanno fornito ai ricercatori una fonte notevolmente ampliato di pentolaprefe- materie prime ^4. I metodi di analisi standard per quantificare le caratteristiche chimiche di un impianto, mentre molto utile per piccole serie di campioni, sono inadatti per lo screening rapido di centinaia o migliaia di campioni ^5-7. I metodi qui descritti HTP sono stati sviluppati per valutare rapidamente ed efficacemente un gran numero di varianti di biomassa per i cambiamenti nella parete cellulare recalcitrance al degrado termochimico e / o enzimatico.

E 'fondamentale capire che i test di screening HTP qui descritti non sono state progettate per massimizzare la conversione o la resa. L'obiettivo è quello di determinare differenze relative recalcitrance intrinseca dei campioni relativa alla biomassa. Come risultato, molte delle fasi di analisi differiscono dai saggi "tipici" di conversione di biomassa, in cui l'obiettivo è di ottenere massima velocità di conversione o portata. Ad esempio, inferiori gravità pretrattamento e tempi di idrolisi enzimatica più brevi sono usati per massimizzare differirerenze tra i campioni. Nella maggior parte dei casi, carichi relativamente elevati enzimi sono utilizzati per ridurre le differenze dovute a variazioni sperimentali dell'attività enzimatica, che potrebbero falsare i risultati in modo significativo.

Tecniche rapide per determinare la composizione delle pareti cellulari delle piante e gli zuccheri monomerici liberato dopo saccarificazione enzimatica includono la robotica, personalizzati, piastre a 96 pozzetti termochimico compatibili, e modifiche di metodi di laboratorio standard ^8-11 e protocolli strumentali, come la spettroscopia vibrazionale (infrarosso (IR), nel vicino infrarosso (NIR), o Raman) e la risonanza magnetica nucleare (NMR) ^12-17. Queste metodologie sono fondamentali per isolare le materie prime ad alto o basso contenuto di cellulosa lignina, o quelli previsti per garantire la massima glucosio, xilosio, etanolo, ecc Questi metodi hanno permesso analisi rimpiccioliti che utilizzano minori quantità di biomassa e di consumo, con conseguente riduzione della sperimentazione spesa ¹⁸ </sup>. Un'altra caratteristica di questo approccio metodologico è che varie condizioni sperimentali possono essere rapidamente, e in alcuni casi contemporaneamente, valutata. Ad esempio, una varietà di differenti strategie di pretrattamento o cocktail di enzimi può essere testato, permettendo parametri sperimentali più ottimali per essere rapidamente identificati e impiegati. Materie prime popolari, come paglia del mais ^9, pioppo ^8,10, canna da zucchero canna da zucchero ^8, e il panico verga ⁸ sono state valutate con successo con questi metodi HTP.

Lignina totale e composizione monomerica lignina sono anche comunemente quantificati tratti biomassa. La riduzione del contenuto di lignina hanno dimostrato di aumentare la digeribilità enzimatica di polisaccaridi ^19,20. Il ruolo che il rapporto monomerica lignina (spesso riportato come syringyl / guaiacyl (S / G) contenuto) gioca nella decostruzione della parete cellulare vegetale è ancora sotto inchiesta. Alcuni report hanno indicato che riduzioni della S / Grapporto ha portato a un incremento delle rese di glucosio successiva all'idrolisi ^21, mentre altri studi svelano la tendenza opposta ^19,22. Metodi High Throughput per la valutazione lignina e dei suoi monomeri comprendono spettroscopia vibrazionale (IR, NIR, Raman e ^23-26) accoppiata con analisi multivariata, e pirolisi spettrometria di massa a fascio molecolare (pyMBMS) ^27,28.

Quando lo sviluppo di metodi di screening per HTP biomassa, diverse considerazioni integrali devono essere tenuti in considerazione. Un aspetto fondamentale è la complessità del metodo. Qual è il livello di abilità richiesto per la tecnica? Analisi chemometric, per esempio, richiedono competenze specifiche per la costruzione, la valutazione, e il mantenimento di modelli predittivi. I metodi standard presentano indesiderati fasi di analisi preparatoria o dati o utilizzano reagenti tossici. Sviluppo dei modelli è un processo continuo in cui i nuovi dati vengono incorporati nel modello nel tempo per aumentare la robustezza del modello. Un'altra considperazione è il risparmio di costi e una diminuzione tempi di analisi sperimentale dei metodi high-throughput proposti. Se il metodo è abbastanza rapida, ma molto costosa, non può essere una tecnica praticabile per molti laboratori di adottare. I metodi illustrati in questo manoscritto sono varianti di tecniche standardizzate, modificate per amplificare le capacità di throughput. Questi protocolli quantitativamente misurano i tratti di biomassa di interesse senza richiedere lo sviluppo di modelli predittivi. Questa è una caratteristica fondamentale di queste tecniche, poiché metodi predittivi, mentre esibendo forti correlazioni con l'analisi standard utilizzata per sviluppare i modelli, non sono precisi come effettivamente misurare la quantità di interesse per i campioni. Considerando che i metodi utilizzati sono sostanzialmente ridimensionato le versioni di metodi analitici standard di bench-scala, accuratezza e precisione sono negoziati per la velocità e il throughput. Per lo più, questo risultato è dovuto ad errori più elevati in piccolo pipettaggio volume e di peso; così come una maggiore sampia eterogeneità dimensione del campione è diminuita. Mentre le grandi serie di campioni possono essere esaminati e confrontati, grande attenzione deve essere esercitata quando si effettua il confronto tra campagne distinte e ai risultati panca scala.

La maggior parte delle fasi dispendiose comportano la manipolazione fisica della biomassa. Campioni di rettifica può richiedere diversi minuti per campione, compresa la pulizia fuori del mulino tra i campioni. Caricamento manuale, scarico, e tramogge di pulizia e riempimento e svuotamento bustine di tè e sacchetti di campionamento è anche molto alta intensità di lavoro. Mentre ogni passaggio potrebbe richiedere un minuto o più, fare migliaia di campioni possono richiedere molte ore o persino giorni. I robot possono caricare un piatto tipico reattore con biomassa in circa 3 a 4 ore o 6 per 8 piastre giorno ^-1 robot ^-1. Questa situazione dipende dai parametri di precisione utilizzati nonché il tipo e la quantità di biomassa da testare. Riempimento reattore piastre con acqua, acido diluito, o enzima viene rapidamente fatta usando un robot manipolatore liquido. Pritrattamento di una piastra pila (da 1 a 20 piastre reattore) dura tra 1 e 3 ore durante il montaggio, raffreddare e smontaggio è inclusa. Idrolisi enzimatica dura 3 giorni e l'analisi zucchero richiede circa 1 ora di tempo di preparazione, più 10 minuti per piastra reattore per completare il test e leggere i risultati. Un programma settimanale di set di pretrattamento e di analisi giorni ospita un programma di lavoro ragionevole, riducendo al minimo dispari ore e week-end sforzi per la componente umana del test e consentono l'elaborazione ~ 800 a 1.000 campioni settimana su base continuativa. La velocità massima dipende da diversi fattori, soprattutto la quantità di hardware (robot, reattori piatti, etc.) e la quantità di "software" (vale a dire, il personale) sono a disposizione per fare il lavoro manuale. Il limite superiore è pratico 2.500 a 3.000 campioni / settimana; tuttavia, che la produzione richiede operazione 7 giorni a settimana e più stagisti e tecnici degli studenti. In confronto, 3.000 campioni mediante HPLC richiederebbe circa 125 giorni di samanalisi ple più del lavoro aggiuntivo di pesare manualmente i campioni in reattori e campioni di filtraggio prima dell'analisi.

Protocol

1. Alta-throughput determinazione del glucosio e xilosio rendimenti seguito enzimatica saccarificazione 9,29 Preparazione del campione (macinazione, De-inamidatura, estrazione, pretrattamento) Macinare almeno 300 mg di ciascun campione biomassa utilizzando un mulino Wiley, tale che le particelle passano attraverso una maglia 20 (850 micron) schermo. Trasferimento a zip-top sacchetti antistatici (in genere con codici a barre) e le informazioni sul campione record al database di codici a bar…

Representative Results

L'effetto combinato del pretrattamento termochimica e successiva saccarificazione enzimatica è misurata in funzione della massa di glucosio e xilosio rilasciato alla fine del test. I risultati sono riportati in termini di milligrammi di glucosio e xilosio rilasciato per grammo di biomassa. Ciò è in netto contrasto con i dati riportati da saggi di bench-scala, che di solito è riportato come percentuale rendimento teorico basato sull'analisi compositiva del materiale di partenza. Poiché non è ancora pratico …

Discussion

Le fasi di preparazione del campione chiave per ottenere dati accurati e riproducibili per lo svolgimento di esperimenti di screening high-throughput sono i seguenti:

Zucchero saggio di rilascio:

In generale, i campioni sono preparati in lotti che vanno da poche decine a diverse migliaia per volta. Ogni punto importante è tipicamente effettuata per tutti i campioni prima di andare avanti al fine di minimizzare le variazioni in preparazione tra i campioni. De-ina…

Materials

Wiley mill	Thomas Scientific	3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill)
anti-static bags	Minigrip*	MGST4P02503	2.5×3", multiple suppliers available
tin-coated copper wire	McMaster-Carr	8871K84	0.016" diameter, bend-and-stay wire
tea-bags	Herbco	press n' brew teabags	3.5×5 inches
gluco-amylase	Novozymes	Spirizyme Fuel
alpha-amylase	Novozymes	Liquozyme SC DS
sodium acetate trihydrate	any chemical supplier		reagent grade
acetic acid	any chemical supplier		reagent grade
190 proof (95%) ethanol	any chemical supplier		reagent grade
hoppers	Freeslate
96-well C-276 Hastelloy plates	Aspen Machining (Lafayette, Colorado)	N/A (custom built)
1/8” soldering iron tip	Sears
silicone-adhesive backed Teflon tape	3M	5180	3" wide (36-yard rolls)
enzyme solution	Novozymes		Cellic CTec2
citric acid monohydrate	any chemical supplier
trisodium citrate dihydrate	any chemical supplier
disposable, polystyrene 96-well plates	Greiner Bio-One	655101	or equivalent; multiple suppliers available
glucose oxidase/peroxidase	Megazyme	K-Gluc	Megazyme D-glucose assay kit
xylose dehydrogenase	Megazyme	K-Xylose	Megazyme D-xylose assay kit
glucose standard solution	Megazyme	K-Gluc	Megazyme D-glucose assay kit
xylose standard solution	Megazyme	K-Xylose	Megazyme D-xylose assay kit
stainless steel sample cups	Frontier Laboratories	PY1-EC80F
glass fiber sheets	Pall	66227	8×10" sheets–circles punched with standard hole punch
Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock	NIST	8491
Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock	NIST	8492
Monterey Pine Whole Biomass Feedstock	NIST	8493
Wheat Straw Whole Biomass Feedstock	NIST	8494