Toplam Lignin, lignin Monomer ve enzimatik Şeker Yayın: Lignocellulosic Biyokütle rekalsitrantların Varyasyonları yüksek verimlilik Taraması
Summary
Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.
Abstract
The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.
Introduction
Olmayan yenilenebilir yakıtlar ve bunlarla ilgili ürünlerin düşüşler küresel kaynağı olarak, bilim adamları bitki kökenli kaynaklardan 1 benzer yakıtlar ve kimyasallar oluşturmak için meydan oylandı. Bu çalışmanın önemli bir yönü, bitki türleri biyoyakıt ve biyomalzeme 2,3 üretilmesi için uygun olabilecek belirlemektir. Tipik olarak, bu besleme stokları lignin, selüloz ve hemiselüloz içeriği için değerlendirilir; ile de veya sonradan enzim sakarifikasyon olmadan, termal, mekanik ve / veya kimyasal ön yoluyla yapısızlaştırma (rekalsitrantların) kendi duyarlılık olarak. Daha detaylı bir analizi gerekiyordu lignin ve yarı selüloz parçacığına spesifik bileşim olarak uygun enzim aktivitelerini belirlemek için kullanılır. Özünde istenilen emtia biyokimyasal veya termokimyasal dönüşüm için ideal özelliklere sahip olmayan bitkilerin transgenik değişiklikler pot bir ölçüde genişletilmiş kaynağı ile araştırmacıların sağladıential hammaddeler 4. Küçük bir numune kümesi için oldukça yararlı ise, bir bitkinin kimyasal özelliklerini ölçülmesi için standart analitik metotlar, örnekler 5-7 yüzlerce ya da binlerce süratle taranması için uygun değildir. Burada tarif edilen yöntemler, HTP hızlı ve verimli bir termokimyasal ve / veya enzimatik degradasyona hücre duvarı rekalsitrantların değişiklikler için biyokütle varyantlarının çok sayıda değerlendirmek için geliştirilmiştir.
Bu HTP tarama deneyleri burada tarif edilen dönüşüm ya da verim en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmış değil anlamak için önemlidir. Amaç, ilgili biyokütle örneklerinin içsel rekalsitrantların nispi farklılıkları belirlemektir. Bunun bir sonucu olarak, analiz adımları birçok amacı, maksimum dönüşüm hızını veya derecesini elde etmek için bir "tipik" biyokütle dönüşüm deneylerinde, farklıdır. Örneğin, daha düşük ön-muamele şiddeti ve daha kısa enzim hidrolizinden kat farklılık en üst düzeye çıkarmak için kullanılırörnekler arasında daha olgun. Pek çok durumda, nispeten yüksek enzim yükler önemli ölçüde sonuçlan saptıracaktır olabilir enzim etkinliği deneysel varyasyon, bağlı farkları azaltmak için kullanılır.
Bitki hücre duvarlarına ve monomerik şekerlerin bileşimin belirlenmesi için hızlı teknikler enzimatik sakarifikasyon kızıl ötesi gibi titreşim spektroskopisi gibi robotik, özel, termo kimyasal uyumludur, 96 gözlü levhalar, ve standart laboratuar yöntemleri 8-11 arasında modifikasyon ve enstrümantal protokolleri (şunlardır açığa çıkan (IR), yakın kızıl ötesi (NIR) ya da Raman) ve nükleer manyetik rezonans (NMR), 12-17. Bu metodolojiler, deneysel azalmalara neden yüksek selüloz veya düşük lignin içeriğinin, ya da en yüksek glikoz, ksiloz, etanol vermesi beklenen olanlar, vb Bu yöntemler biyokütle ve sarf küçük miktarlarda istihdam downscaled analizler sağlamıştır ile hammaddeleri izole anahtarıdır Gider 18 </s> yedekleyin. Bu yöntem yaklaşımın diğer bir özelliği, çeşitli deneysel koşullar hızlı olabilir ve aynı zamanda bazı durumlarda değerlendirilmiştir. Örneğin, ön-muamele stratejileri veya enzim kokteyl, farklı çeşitli en uygun deney parametreleri hızla tespit kullanılabilir sağlayan test edilebilir. Örneğin, mısır koçanından 9, kavak 8,10, şeker kamışı küspe 8 ve switchgrass 8 gibi popüler besleme stokları, başarılı bir şekilde, bu HTP yöntemler kullanılarak değerlendirilmiştir.
Toplam lignin ve lignin monomerik kompozisyon da yaygın biyokütle özellikleri ölçülür. Lignin içeriğindeki azalmalar polisakkaritler 19,20 enzimatik sindirilme artırmak için gösterilmiştir. Lignin monomerik oranı (genellikle syringly / guaiacyl (S / G) içerik olarak rapor) bu rolü soruşturma altında hala bitki hücre duvarının yıkılmasında oynar. Bazı raporlar belirttiler S / G azalmalardiğer çalışmalar zıt eğilim 19,22 açıklayacak ederken oranı hidroliz 21 aşağıdaki artan glikoz verimi yol açtı. Lignin ve monomerleri değerlendirmek için yüksek kapasiteli yöntemleri titreşim çok değişkenli analiz ile birleştiğinde spektroskopisi (IR, NIR ve Raman 23-26) ve piroliz moleküler ışın kütle spektrometresi (pyMBMS) 27,28 sayılabilir.
Biyokütle taranması için HTP yöntemleri geliştirirken, birkaç ayrılmaz hususlar göz önünde tutulması gerekir. Bir önemli yönü yönteminin karmaşıklığı olduğunu. Teknik için gerekli beceri düzeyi nedir? Kemometrik analizler, örneğin, inşa değerlendirilmesi ve tahmini modeller korumak için özel beceriler gerektirir. Standart yöntemler istenmeyen hazırlayıcı veya veri analiz adımları sergilemek veya zehirli reaktifler kullanır. Modellerin geliştirilmesi, yeni veri modelin sağlamlığı artırmak için zamanla modele dahil edilmiştir devam eden bir süreçtir. Başka bir consideration maliyet tasarrufu ve önerilen yüksek verimlilik yöntemlerinin deneysel analiz sürelerini azalmıştır. Yöntem oldukça hızlı, ancak oldukça maliyetli ise, çok sayıda laboratuar kabul etmek için uygulanabilir bir teknik olabilir. Bu yazıda gösterildiği yöntemler verim özelliklerini güçlendirmek için modifiye standart teknikler türevleridir. Bu protokoller nicel öngörü modellerinin geliştirilmesi gerektirmeden ilgi biyokütle özelliklerini ölçmek. Standart modelleri geliştirmek için kullanılan analizleri ile güçlü bir korelasyon sergilerken Bu öngörü yöntemleri beri bu tekniklerin önemli bir nitelik olduğunu, aslında numunelerde ilgi miktarını ölçmek gibi doğru değildir. Esasen standart tezgah ölçekli analitik yöntemlerin sürümleri küçülttüm Kullanılan yöntemler ise doğruluk ve hassasiyet hız ve performans için işlem görmektedir. Çoğunlukla, bu sonucun küçük hacimli pipetleme ve tartı yüksek hatalar nedeniyle; ve artan sörneklem büyüklüğü olarak geniş heterojenite azalır. Büyük örnek setleri ekranlı ve mukayese edilebilir olsa ayrı kampanyalar arasında ve tezgah ölçekli sonuçlarına karşılaştırmalar yaparken, büyük bir özenle olunmalıdır.
En zaman alıcı adımlar biyokütle fiziksel manipülasyon içerir. Taşlama örnekler örnekler arasındaki değirmen temizleme dahil numune başına birkaç dakika sürebilir. Elle, boşaltma ve temizleme bunker yükleme ve doldurma ve çay poşetleri ve örnek çanta boşaltma da çok emek yoğundur. Her adım bir dakika veya daha fazla sürebilir iken, numunelerin yapıyor binlerce birçok saatler hatta günler sürebilir. Robotlar yaklaşık 3 ila 4 saat veya 6 -1 tabak gün 8 robot biyokütle ile tipik bir reaktör plakasını yükleyebilirsiniz -1. Bu durum, aynı zamanda, test edilecek Çeşidi ve biyokütle miktarı olarak kullanılan hassas parametrelere bağlıdır. Reaktörü su plakaları Benzin, seyreltik asit veya enzim hızlı bir sıvı kotarma robotu kullanılarak yapılır. PBir plaka yığıtı (1 20 reaktör plakalar) için yeniden tedavi tertibatı, soğuma sırasında 1 ila 3 saat sürer, ve demontaj dahildir. Enzim hidroliz 3 gün sürer ve şeker analiz sonuçları tahlil tamamlamak ve okumak için hazırlık süresi yaklaşık 1 saat artı reaktör plaka başına 10 dakika gerektirir. Set Tedavi öncesi ve analiz gün bir haftalık program sürekli olarak haftada ~ 800 1000 örnekleri tahlil insan bileşeni için tek saat ve hafta sonu çabalarını en aza indirerek, makul bir çalışma programı barındırır ve işlenmesi için izin verir. Maksimum verim çok donanım (robotlar, reaktörler tabak, vb) ve ne kadar "yazılım" (yani, personel) el işi yapmak için kullanılabilir başta nasıl birçok faktöre bağlıdır. Pratik üst sınır 2500 3.000 örnekleri / hafta; Ancak, çıkış 7 gün-bir hafta çalışma ve çok sayıda öğrenci stajyerleri ve teknisyenleri gerektirir. Buna karşılık, HPLC ile 3000 örnekleri sam yaklaşık 125 gün gerektirecektirple analizi artı elle analizden önce reaktörler ve filtreleme numuneleri içine örnekleri tartı ek emek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aşağıdaki gibi yüksek verimli tarama deneyleri yaparken doğru ve tekrarlanabilir verilerini elde etmek için temel örnek hazırlama adımları şunlardır:
Şeker Salma Deneyi:
Genel olarak numuneler, birkaç düzine bir kerede birkaç bin arasında değişen sayıda hazırlanır. Her önemli bir adım, tipik olarak örnekler arasında hazırlanmasında değişimleri en aza indirmek için ileri doğru hareket önce, bütün numuneler için gerçekleştirilm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank intern Evelyn Von Neida who provided paramount insights regarding the preparation of biomass samples for both of the high-throughput pipelines discussed in this manuscript. Support for the development of this work and manuscript was provided by the BioEnergy Science Center. The BioEnergy Science Center is a U.S. Department of Energy Bioenergy Research Center supported by the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. The National Renewable Energy Laboratory (NREL) is a national laboratory of the US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, operated for DOE by the Alliance for Sustainable Energy, LLC. This work was supported by the U.S. Department of Energy under Contract No. DE-AC36-08-GO28308 with the National Renewable Energy Laboratory.
Materials
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | ||
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5×3", multiple suppliers available | |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire | |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5×5 inches | |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | ||
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | ||
|
any chemical supplier | reagent grade | ||
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | ||
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | ||
| hoppers | Freeslate | |||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | ||
| 1/8” soldering iron tip | Sears | |||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) | |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | ||
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | |||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | |||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available | |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit | |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit | |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit | |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit | |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | ||
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8×10" sheets–circles punched with standard hole punch | |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | ||
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | ||
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | ||
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
- Perlack, R. D., Stokes, B. J. . U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).
- Henry, R. Ch. 5. Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , 53-80 (2009).
- Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
- Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
- DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
- Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
- Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
- Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
- Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
- Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
- Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
- Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
- Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
- Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
- Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
- Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
- Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).
- Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
- Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
- Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. Within tree variability of lignin composition in Populus. Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).
- Sykes, R., Mielenz, J. R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. 581, 169-183 (2009).
- Decker, S., Himmel, M. E., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. 908, 181-195 (2012).
- Evans, R. J., Milne, T. A. Molecular characterization of the pyrolysis of biomass. Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).
