Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.
Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of >10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.
לירולוגים RNA, כניסתו של טכנולוגיית ה- DNA רקומביננטי בשנתי ה -1970 המאוחרות שאפשר להמיר את הגנום רנ"א נגיפי לשיבוטי cDNA, אשר לאחר מכן יכול להיות מופץ כפלסמידים בחיידקים למניפולציה הגנטית של נגיפי RNA. 1 להיות וירוס RNA הראשון מולקולרי המשובטים היה Qβ bacteriophage, וירוס RNA חיובי גדיל שמדביק coli Escherichia. פלסמיד המכיל עותק cDNA מלא של RNA הגנומי Qβ הוליד פאגים Qβ זיהומיות כאשר הציג לE. coli. 2 זמן קצר לאחר מכן, בטכניקה זו יושמה לנגיף פוליו, נגיף RNA חיובי גדיל של בני אדם ובעלי חיים. פלסמיד הנושא cDNA באורך מלא של RNA הגנומי נגיף הפוליו היה מידבק כאשר transfected לתאי יונקים ומסוגלים לייצר virions זיהומיות 3 בזה גישה "שהושק ה- DNA", צריך להיות עיבד cDNAs המשובט intracellularly ליזום שכפול רנ"א נגיפי.;עם זאת, לא ברור כיצד השעתוק הוא יזם ואיך התמלילים מעובדים לרצף הנגיפי הנכון. חשש זה הוביל לפיתוח של חלופה "שהושק RNA" גישה, לפיה עותק cDNA מלא של הגנום רנ"א הנגיפי הוא משובט תחת אמרגן מוכר על ידי א ' coli או RNA פולימראז הפאג לייצור RNAs הסינתטי במבחנה עם 'ו 3' טרמיני המוגדרים 5, שעובר את מחזור השכפול הנגיפי השלם כאשר הוכנסו לתאי מארח. 4,5 ההצלחה הראשונה עם גישה זו דווחה לוירוס פסיפס ברום , 6,7 וירוס RNA חיובי גדיל של צמחים. מאז, הגישה השיק RNA פותחה עבור מגוון רחב של וירוסי RNA חיובי גדיל, כולל caliciviruses, alphaviruses, flaviviruses, arteriviruses, וקורונה. 1,4,5,8
בשני דנ"א ורנ"א השיק מערכות גנטיקה הפוכה, הבנייה של פולשיבוט cDNA L-אורך הוא המפתח ליצירת DNA או RNA של וירוסי RNA חיובי גדיל מדבק, אבל זה הופך להיות אתגר משמעותי טכני כמו הגודל של עליות הגנום נגיפיות. 9-17 בפרט, הגנום RNA גדול של ~ 10 -32 Kb מציג שלושה מכשולים עיקריים לשיבוט של cDNA הפונקציונלי באורך מלא. 18 הקושי הראשון הוא הסינתזה של cDNA נאמן להעתיק, מאז הנאמנות של RT-PCR היא ביחס הפוך לאורכו של רנ"א הנגיפי. המשוכה השנייה היא נוכחותם של רצפים רעילים, מאז מולקולות RNA ארוכות יותר עלולות להכיל רצפים בלתי צפויים מסוגלים לבצע את בר cDNA בפלסמידים לא יציבים בE. coli. הנושא השלישי והקריטי ביותר הוא הזמינות של וקטור מתאים, שכן קשה למצוא וקטור שיבוט שיכול לשכן להוסיף cDNA ויראלי של> 10 KB. במהלך שלושת העשורים האחרונים, חסמים אלה היו להתגבר על ידי כמה התקדמויות בenzymology, מתודולוגיה,vectorology ד. 1,4,5,8 מבין אלה, הפיתוח המבטיח וחדשני ביותר הוא השיבוט של וירוסים גדולים חיובי גדיל RNA כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי זיהומיות כ( BACS). וקטור BAC הוא פלסמיד נמוך עותק שיבוט (1-2 עותקים / תא) המבוסס על ה גורם פוריות coli, עם גודל ממוצע של ה- DNA להוסיף ~ 120-350 kb 19-21 קטע DNA מוכנס לתוך וקטור BAC באופן דומה לשיבוט לתוך וקטורי שיבוט כלליים.; השיבוטים BAC וכתוצאה מכך הם יציבים לאורך דורות רבים בE. coli. 22,23 עד כה, טכנולוגית BAC נעשה שימוש כדי ליצור שיבוטים cDNA מדבקים ל> 10 חברי שלוש משפחות חיוביות גדיל RNA וירוס, כלומר, Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 וCoronaviridae. 9,16,17 , 31,32
שימוש בוירוס דלקת מוח יפני (JEV) כדוגמא, את העבודה הנוכחית מדווחת נהלים מפורטים שיכול להיותמשמש לבניית BAC זיהומיות באורך מלא יציב מבחינה גנטית עבור מגוון רחב של וירוסי RNA חיובי גדיל. JEV הוא flavivirus zoonotic 33 שמועבר בטבע בין ציפורים, חזירים, ומארחי חוליות אחרים על ידי וקטורי יתושים. 34,35 בבני אדם, זיהום JEV יכול לגרום לדלקת קרום המוח הקטלנית לעתים קרובות החמורה המחלה נוירולוגית היפנית (י"א), 36 אשר מתרחש ב אסיה וחלקים של האוקיינוס השקט במערב, 37,38 עם שכיחות שנתית משוערת של ~ 50,000-175,000 מקרים קליניים. 39,40 הגנום של JEV היא 11 KB, מולקולה ~ חד-גדילים, חיובי תחושת RNA ומורכבת מסגרת קריאה פתוחה יחידה (ORF) מוקפת שני אזורי קידוד-עישון (NCRs) ב5 'ו 3' מסתיימת. 41,42 ORF מקודד polyprotein שהוא ביקע על ידי מארח ופרוטאזות הנגיפית כדי לייצר 10 חלבונים בודדים, מיועד C, PRM, E, ns1, NS2A, NS2B, ns3 NS4A, NS4B, וNS5 בN- לכיוון C-מסוף. 34,43,44 כמו כן, דוארטופס xtended של ns1 (ns1 ') בא לידי הביטוי על ידי -1 frameshifting ריבוזומלי בקודונים 8-9 של NS2A. 45,46 של 11 חלבונים אלה, שלושה החלבונים המבניים (C, PRM, ו- E) הם חיוניים ליצירה של זיהומיות virions, 47,48 ושמונת חלבוני nonstructural הנותרים (ns1 לNS5, וns1 ') הם קריטיים עבור שכפול נגיפי RNA, הרכבה 49-51 חלקיקים, 52-56 והתחמקות חסינות מולדת. 57-59 שניהם 5' ו 3 "NCRs מכיל רצפי שימור ראשוניים ומבני RNA צורה משניים / יישונים, 60-62 שהם חשובים לויסות שכפול רנ"א נגיפי. 63,64
פרוטוקול זה מתאר את הכלים, שיטות והאסטרטגיות ליצירת באורך מלא BAC זיהומיות של JEV 14 SA -14-2. 28 שיבוט BAC פונקציונלי זה מכיל עותק מלא cDNA של RNA הגנומי JEV, 65 אשר הקיף על ידי אמרגן לRNA פולימראז SP6 במעלה הזרםשל 5'-הסוף הנגיפי ואתר הגבלה ייחודי Xba אני במורד הזרם של 3'-הסוף הנגיפי במבחנה תעתיק ניגר. טכנולוגית BAC זה חל על בניית שיבוט מולקולרי cDNA פונקציונלי מלא עבור מערך של וירוסי RNA חיובי גדיל.
הפרוטוקול הנוכחי שמש בהצלחה לייצר שיבוטים cDNA זיהומיות באורך מלא לשני זנים שונים (CNU / 27 LP2 ו -14 SA -14-2 28) של JEV, flavivirus שפונקציונלי cDNA הוכיח להיות קשה מטבעו לבנות ו להפיץ בגלל רעילות תא מארח וחוסר היציבות הגנטית של cDNA המשובט 8,74-76 פרוטוקול זה כולל שלושה מרכיבים עיקריים:. ראשון, למקסם את הסינתזה / ההגברה של עותק cDNA נאמן של רנ"א הנגיפי באמצעות טרנסקריפטאז באיכות גבוהה / DNA פולימראז; שני, שיבוט האזור הנגיפי PRM-E קידוד המכיל רצפים רעילים (נתונים שלא פורסמו) 74,77,78 בBAC וקטור מספר מאוד נמוך עותק מcDNA הראשוני subcloning לצעדי ההרכבה cDNA באורך מלא הסופיים; ושלישית, ניצול BAC וקטור שיבוט שיכול להכיל דנ"א זר עם גודל של 120-350 kb, 19-21 ממוצע שככל הנראה סובל inse DNA הגדולRTS מאשר לעשות וקטורי שיבוט אחרים. גישת שיבוט זה תהיה בדרך כלל החלים רב וירוסים אחרים חיובי גדיל RNA, במיוחד אלו עם הגנום RNA גדול של ~ 10-32 קילו. דור של שיבוט cDNA זיהומיות הוא צעד מפתח בפיתוח מערכת גנטיקה הפוכה לאיתור וירוסי RNA, במיוחד לוירוסי RNA חיובי גדיל, כי הגנום שלו פועל mRNA ויראלי כמו שמתורגמת לחלבונים על ידי הריבוזומים תא מארח. לפיכך, שכפול נגיפי יכול להיות שיזם את ההקדמה של מולקולת רנ"א הגנום באורך נגזר cDNA לתוך תא מארח רגיש. הזמינות של שיבוט JEV cDNA זיהומיות, בשילוב עם טכנולוגיית ה- DNA רקומביננטי, גדלה ההבנה של היבטים שונים של מחזור החיים של נגיפנו ברמה המולקולרית, כגון ביטוי גנים 73,79 ושכפול הגנום. 63,64 כמו כן, באורך מלא שיבוט JEV cDNA הוכיח להיות כלי רב ערך לפיתוח של חיסונים אנטי 28 ווקטורי מסירת הגן. <sup> 80,81
כמו בכל וירוסי RNA חיובי גדיל, ישנם צעדים קריטיים מרובים בבניית cDNA הפונקציונלי אמין לJEV שממנו יכול להיות מסונתז RNAs המידבק ביותר במבחנה. באופן אידיאלי, הרצף של RNAs הסינתטי עיבד משיבוט של cDNA באורך מלא צריך להיות זהה לזה של RNA הגנומי ויראלי, במיוחד 5'- ו3'-מסוף הרצפים הנדרשים לייזום של שכפול רנ"א הנגיפי . 60-62 בפרוטוקול הנוכחי, האותנטי 5'- ו3'-קצוות היו מובטח על ידי הצבת רצף אמרגן SP6 במעלה הזרם של נוקלאוטיד אדנין הראשון של הגנום הנגיפי ומיצוב אתר הגבלה ייחודי מלאכותי Xba אני במורד זרם של האחרון נוקלאוטיד תימין של הגנום הנגיפי, בהתאמה. כתרים RNAs הסינתטי עם 5 האותנטיים 'ו 3' קצוות הופקו על ידי שעתוק נגר של te cDNA Xba אני-לינארית וטופל MBNmplate באמצעות פולימראז SP6 RNA דרוך עם G מ '7 (5') PPP (5 ') אנלוגי כובע. פרוטוקול זה יכול להיות שונה בכמה דרכים. לשעתוק במבחנה, אחר RNA פולימראז bacteriophage (למשל, T3 או T7) יכול לשמש בשילוב עם רצף האמרגן המוגדר היטב שלה. 27 כאתר נגר, אתר הגבלה שונה יכול להיות מנוצל אם היא לא נמצאת ב הגנום הנגיפי ואם RNA הסינתטי מcDNA לינארית מסתיים בסופו של הדבר האותנטי 3 '. החשיבות של רצף נוקליאוטידים 3'-הסוף הודגמה על ידי ירידה ~ של פי 10 בinfectivity RNA כאשר RNA סינטטי מכיל שלושה או ארבעה נוקלאוטידים וירוס-שאינו קשור בסופה 3 ". 27 בתגובת שעתוק במבחנה, שני מ '7 G (5') PPP (5 ') ומטר 7 G (5') PPP (5 ') אנלוגי כובע יכול לשמש G באותה מידה, אם כי המקומות האחרונים נוקלאוטיד G נוסף שאינו קשור במעלה הזרם של נגיפי 5 "-end, אבל שבנוסף אינו משנה את ההדבקה או שכפול של RNA הסינתטי. 27 יתר על כן, הסרת תבנית cDNA מתעתיקי הרנ"א על ידי DNase אני עיכול אין צורך לבדיקות infectivity RNA, כי תבנית cDNA עצמו אינה מדבקת. 27
טכנולוגית BAC עכשיו הוחל בבניית השיבוטים cDNA מדבקים לקומץ של וירוסים חיוביים גדיל RNA, כלומר, שתי JEVs, CNU / 27 LP2 וSA 14 -14-2 28 (גודל הגנום, ~ 11 KB); שני וירוסים דנגה, BR / 90 26 ו- NGC 29 (~ 11 KB); וירוס שלשולים הנגיפי שור, SD1 (~ 12 KB); 25 שני וירוסים קלאסיים קדחת חזירים, C ו- פאדרבורן (~ 12 KB); 24 וירוס המחלה גבול, Gifhorn (~ 12 KB); 24 וירוס תסמונת רבייה ונשימה חזירי , PL97-1 / LP1 (~ 15 KB); 30 וירוס גסטרו-ההעברה, PUR46-MAD (~ 29 KB); 16 וירוס דלקת הצפק המדבק של חתולים,DF-2 (~ 29 KB); 32 קורונה החמור החריף בדרכי הנשימה תסמונת, Urbani (~ 30 KB); 9 קורונה תסמונת הנשימה המזרח התיכון, EMC / 2012 (~ 30 KB); 17 וקורונה האנושי, OC43 (~ 31 KB) 31 היתרון העיקרי של שימוש בBACS לבניית cDNA הוא היציבות הגנטית הגבוהה של פלסמידים BAC הגדולים, 1 או 2-עותק.; עם זאת, הטבע הפנימי של מאוד נמוך העותק מספרו הוא גם חסרון גדול, בגלל תשואות נמוכות מאוד של DNA BAC וההפחתה הסוגר בטוהר של ה- DNA BAC ביחס לארח DNA כרומוזומליות. בפרוטוקול הנוכחי, התשואה של BAC DNA מוגדל על ידי גידול E. coli DH10B הפך עם pBAC BAC המדבק / 14 SA -14-2 במדיום עשיר בחומרים מזינים, 2xYT. למרות מאמץ זה, התשואה הממוצעת היא רק ~ 15 מיקרוגרם של ה- DNA BAC מ 500 מיליליטר של מרק 2xYT. כמו כן, את הטוהר של ה- DNA BAC הוא הטוב ביותר להשיג באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות CsCl-EtBr לטיהור, ולא בידוד פלסמיד המבוסס על טור הנפוץ. עם זאת, חשוב לזכור כי א-שינה BAC coli לא צריך לגדול יותר, כי זה עלול לסכן את היציבות הגנטית של cDNA המשובט, וצמיחה גבוהה יותר לא בהכרח תוביל לתשואות גדולות יותר או DNA BAC גבוה-הטוהר.
הפרוטוקול המתואר כאן הוא ושיטה מותאמות, יעילים, יעילה לבנייה וההפצה של שיבוט cDNA זיהומיות יציב מבחינה גנטית באורך מלא כBAC לJEV, הליך חשב כמעט בלתי אפשרי פעם אחת. אותה אסטרטגית שיבוט זה יכול גם להיות מיושם לרב וירוסי RNA חיובי גדיל אחרים. באופן כללי, שיבוטים cDNA זיהומיות יאפשר לנו להציג את מגוון רחב של מוטציות (למשל, מחיקות, הוספות, ומוטציות נקודה) לגנום רנ"א נגיפי ללמוד פונקציות הביולוגיות שלהם בשכפול ופתוגנזה ויראלי. מערכת גנטיקה ההפוכה מבוסס cDNA זה מאפשר לפתח וTESחיסון לא ומועמדים טיפוליים מיקוד גורם ארסיות (ים) של נגיף RNA חיובי גדיל מסוים של עניין. בנוסף, טכנולוגית cDNA זיהומיות זה יכול גם לשמש כוקטור נגיפי, מסוגל להביע גן זר (ים) של עניין עבור יישומים רבים במחקר ביו-רפואי.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.
1. Molecular Cloning | |||
2xYT Broth | Sigma-Aldrich | Y2377 | |
[3H]UTP | PerkinElmer | NET380250UC | Radioactive |
50-mL Tube | Thermo Scientific (Nalgene) | 3114-0050 | |
250-mL Bottle | Beckman Coulter | 356011 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Agarose (Low Melting Point) | Life Technologies (Invitrogen) | 16520-100 | |
AvaI | New England BioLabs | R0152S | |
AvrII | New England BioLabs | R0174S | |
BamHI | New England BioLabs | R0136S | |
BsiWI | New England BioLabs | R0553S | |
BsrGI | New England BioLabs | R0575S | |
Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
Cap Analog [m7G(5ʹ)ppp(5ʹ)A] | New England BioLabs | S1405S | |
Cesium Chloride | Fisher Scientific | BP1595-1 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Carcinogenic |
DE-81 Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 3658-023 | |
dNTP mix | Life Technologies (Invitrogen) | 18427-088 | |
E. coli DH10B | Life Technologies (Invitrogen) | 18297-010 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | Toxic and highly mutagenic |
Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit) | Life Technologies (Invitrogen) | K2100-26 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | Irritating |
Glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | |
High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491S | |
Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9392 | Flammable |
Isopropanol | Amresco | 0918 | Flammable |
LB Broth | Life Technologies (Invitrogen) | 12795-027 | |
Lithium Chloride | Sigma-Aldrich | L9650 | |
Lysozyme | Amresco | 0663 | |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
M-MLV Reverse Transcriptase | Life Technologies (Invitrogen) | 18080-044 | |
Mung Bean Nuclease | New England BioLabs | M0250S | |
Needle (18G, 20G) | BD | 305196, 305175 | Biohazardous (Sharps waste) |
NotI | New England BioLabs | R0189S | |
Oligonucleotide | Integrated DNA Technologies | Custom Oligonucleotide Synthesis | |
PacI | New England BioLabs | R0547S | |
pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
Phenol (Buffer-Saturated) | Life Technologies (Invitrogen) | 15513-039 | Toxic and highly corrosive |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Life Technologies (Invitrogen) | 15593-031 | Toxic and highly corrosive |
Phenol:Guanidine Isothiocyanate | Life Technologies (Ambion) | 10296-010 | Toxic, corrosive, and irritating |
Pme I | New England BioLabs | R0560S | |
Potassium Acetate | Amresco | 0698 | |
RNase Inhibitor | Life Technologies (Invitrogen) | 10777-019 | |
rNTP Set | GE Healthcare Life Sciences | 27-2025-01 | |
Sealable Polypropylene Tube (16 × 76 mm) | Beckman Coulter | 342413 | |
SfiI | New England BioLabs | R0123S | |
Sma I | New England BioLabs | R0141S | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | 0227 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
SP6 RNA Polymerase | New England BioLabs | M0207S | |
Spin Column (Plasmid Miniprep Kit) | Life Technologies (Invitrogen) | K2100-11 | |
Syringe | HSW NORM-JECT | 4200.000V0 | |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
Tris | Amresco | 0826 | |
tRNA (yeast) | Life Technologies (Invitrogen) | 15401-011 | |
XbaI | New England BioLabs | R0145S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2. Cell Culture | |||
Alpha Minimal Essential Medium | Life Technologies (Gibco) | 12561-049 | |
Conical Tube (50 mL) | VWR | 21008-242 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
Culture Dish (150 mm) | TPP | 93150 | |
Cuvette (2-mm Gap) | Harvard Apparatus | 450125 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies (Gibco) | 16000-044 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | Toxic and carcinogenic |
Glutamine | Life Technologies (Gibco) | 25030-081 | |
Minimal Essential Medium | Life Technologies (Gibco) | 61100-061 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies (Gibco) | 15070-063 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
Six-Well Plate | TPP | 92006 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies (Gibco) | 25200-056 | |
Vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3. Equipment | |||
Agarose Gel Electrophoresis System | Mupid | MPDEXU-01 | |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | Heracell 150i | |
Desktop Centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
Electroporator | Harvard Apparatus | ECM 830 | |
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld) | UVP | UVGL-58 | |
Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 368826 | |
Thermocycler | Life Technologies (Applied Biosystems) | GeneAmp PCR System 9700 | |
Vortexer | Scientific Industries | G-560 | |
Water Bath | Jeio Tech | WB-10E |