झिल्ली एंजाइमों में विलायक डायनेमिक्स द्वारा प्रेरित Unraveling Entropic दर त्वरण

Summary

एंजाइमों में पानी के अणुओं के परिवहन के लिए चैनल सक्रिय साइट solvation और कटैलिसीस प्रभावित करते हैं। इस के साथ साथ हम सिलिको कंप्यूटर मॉडलिंग और प्रयोगों के आधार पर इन अतिरिक्त उत्प्रेरक रूपांकनों के इंजीनियरिंग के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस एंजाइम कटैलिसीस पर विलायक गतिशीलता के प्रभाव के बारे में हमारी समझ में वृद्धि होगी।

Abstract

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.

Introduction

जल जीवन ^एक के रसायन विज्ञान के लिए एक आधार का गठन किया। जल पैटर्न और एंजाइम सक्रिय साइटों की solvation तापीय धारिता और हाइड्रोफोबिक प्रभाव ^2,3 परे का विस्तार एक अत्यधिक जटिल फैशन में ^1,2 और कटैलिसीस ³ बाध्यकारी ligand के एन्ट्रापी दोनों प्रभावित करते हैं। एनएमआर ^4, उष्मामिति ² और solvated प्रोटीन की आणविक मॉडलिंग ligand के सहयोग से ^5-8, विशिष्टता और गतिविधि ^2,9,10 के लिए एक प्रेरणा शक्ति प्रदान करने में स्पष्ट पानी के अणुओं की भूमिका पर प्रकाश डाला करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस के साथ साथ हम एंजाइम कटैलिसीस पर विलायक विस्थापन की thermodynamical प्रभाव (चित्रा 1) की प्रायोगिक मूल्यांकन के लिए एक अनोखी पद्धति प्रस्तुत करते हैं। हमारा संयुक्त रणनीति एंजाइम इंजीनियरिंग और thermodynamical विश्लेषण (चित्रा 1) के साथ मिलकर कंप्यूटर सिमुलेशन का उपयोग पर आधारित है। इस CATA पर विलायक गतिशीलता के प्रभाव पर अतिरिक्त प्रकाश बहा के लिए अनुमति देता हैवर्तमान में खराब समझा जाता है, जो सेल,।

Solvated एंजाइम सक्रिय साइटों में पानी की मध्यस्थता हाइड्रोजन बांड द्वारा प्रदान की enthalpic बातचीत, स्थिर, entropic दंड ¹ की भरपाई की जा सकती है। थोक ⁵ में पानी की तुलना में ये entropic लागत, प्रोटीन गुहाओं के भीतर ही सीमित पानी के अणुओं द्वारा प्रदर्शित स्वतंत्रता की डिग्री में कमी के साथ जुड़े रहे हैं। आदेश दिया पानी के अणुओं की रिहाई इस प्रकार ligand के सहयोग से ¹ और कटैलिसीस ³ के लिए एक entropic प्रेरणा शक्ति प्रदान कर सकते हैं। विलायक गतिशीलता का एक महत्वपूर्ण पहलू प्रोटीन की आंतरिक और बाहरी विलायक ⁴ के बीच पानी के अणुओं का विस्थापन है। सक्रियण ऊर्जा, तापीय धारिता, और एन्ट्रापी ¹¹ में साथ पूरी तरह से बदल आणविक स्तर पर समझ नहीं रहे हैं। सक्रियण एंजाइमों में पानी के परिवहन, विलायक गतिशीलता के महत्व और उसके योगदान के लिए जिम्मेदार व्यक्ति को सुरंगों में बाधा डालने के द्वाराऊर्जा (चित्रा 1) का मूल्यांकन किया जा सकता है। इसके अलावा, अलग तापमान पर एक बर्तन गतिज प्रयोगों के प्रदर्शन से, कई substrates के रिश्तेदार thermodynamical सक्रियण मापदंडों के प्रयोगों की एक कम संख्या (चित्रा 1, दाएं) से निकाला जा सकता है। हमारे अंतःविषय विधि जीवन ¹² के लिए उच्च महत्व के पॉलीसाइक्लिक terpenes उत्पन्न कि जटिल झिल्ली ही सीमित triterpene साइक्लेस एंजाइमों के लिए मान्य है। प्रोटोकॉल एक मानक सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर झिल्ली प्रोटीन की उच्च मात्रा (10-20 मिलीग्राम / एल) की वसूली के लिए अनुमति देता है।

एंजाइमों पानी में विकसित किया है, कटैलिसीस को बढ़ावा देने में विलायक की भूमिका आमतौर पर उपेक्षित है। आकार संक्रमण राज्य ^{से 15} इलेक्ट्रोस्टैटिक पूरकता के साथ सक्रिय साइटों पूर्व संगठित कि प्रोटीन गतिशीलता ^13,14 के अलावा, पानी की गतिशीलता कुशल एंजाइम कटैलिसीस के लिए उच्च महत्व का हो सकता है। कई अंतःविषय तकनीक बनाकर हमारेउद्देश्य पानी की गतिशीलता और ऊष्मा के अत्यधिक जटिल अध्ययन की सुविधा के लिए है। वैज्ञानिक समुदाय के लिए इन उपकरणों का अधिक सुलभ बनाने बदल गतिविधियों और विशिष्टताओं के लिए एंजाइम इंजीनियरिंग और प्रोटीन डिजाइन में नई रणनीति के विकास को बढ़ावा मिलेगा।

Protocol

1. में सिलिको कम्प्यूटर मॉडलिंग प्रोटीन डाटा बैंक (पीडीबी) से ब्याज की प्रोटीन का एक पीडीबी संरचना करें। अतिरिक्त सब यूनिटों को हटाने और फिर "सेल निराकरण और पी के एक भविष्यवाणी" YASARA 16 में प्रयोग का उपयोग लापता हाइड्रोजन परमाणुओं और स्पष्ट विलायक जोड़कर संरचना तैयार करें। झिल्ली बाध्य triterpene cyclases के लिए, पानी के बॉक्स से उपयुक्त आयाम 91x67x77 एक कर रहे हैं। मैन्युअल catalytically सक्रिय एमिनो एसिड की protonation राज्य को समायोजित करें। नोट: PDB फ़ाइल में एक सब्सट्रेट अनुरूप "संपादित करें | स्वैप | एटम" की मदद से एक वास्तविक सब्सट्रेट करने के लिए संशोधित किया जा सकता यदि आवश्यक आदेश। एम्बर बल क्षेत्र सूट 17 का उपयोग "ऊर्जा न्यूनतम" कमांड द्वारा संरचना कम से कम। लंबी दूरी electrostatic बातचीत के लिए खाते में कण जाल Ewald दृष्टिकोण (PME) 18 का प्रयोग करें। अनुसार वान डर वाल्स बातचीत के लिए कट-ऑफ सेट करेंमानक सेटिंग करने के लिए। नोट: अभिसरण तक पहुँच जाता है "ऊर्जा न्यूनतम" कमांड तो एक छोटी तेज वंश न्यूनीकरण, एक नकली annealing द्वारा गठनात्मक तनाव को दूर (timestep 2 FSEC, 0.9 हर 10 वें कदम से नीचे पहुंचा परमाणु वेग) किया जाता है (यानी, ऊर्जा का सुधार ) 200 चरणों के दौरान परमाणु कम से कम प्रति 0.012 किलो कैलोरी / मोल द्वारा। सक्रिय साइट solvation और पानी के उपयोग की 2. मॉडल नकली annealing के बाद, एक 20 NSEC आणविक गतिशीलता (एमडी) प्रक्षेपवक्र चलाने के लिए और "फाइल | इस रूप में सहेजें | सिमुलेशन स्नैपशॉट" से कम से कम 10 स्नैपशॉट उत्पन्न "अनुकरण पर 'के बाद आदेश। विहित पहनावा के तहत समय-समय सीमा की स्थिति के साथ एक मानक कंप्यूटर पर सिमुलेशन चलाने। एक Berendsen थर्मोस्टेट का उपयोग कर 298 कश्मीर में तापमान बनाए रखें। सभी पानी के अणुओं और अंतिम ligands / substrates का उपयोग हटाने से 2.1 से प्राप्त स्नैपशॉट तैयार4; संपादित करें | हटाएँ | एक के ऊपर दूसरा रखना अवशेष "द्वारा मूल पी डी बी-संरचना पर अलग-अलग आदेश एक के ऊपर दूसरा रखना प्रत्येक स्नैपशॉट।" | वस्तु "आदेश सभी संरचनाओं ही भौगोलिक स्थिति का हिस्सा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक नया पीडीबी के रूप में इस तरह से तैयार प्रत्येक स्नैपशॉट बचाने के लिए। -file (प्रयोग "फ़ाइल | के रूप में सहेजें | पी डी बी" कमांड)। अनुभवी मॉडलर के लिए: नोट अनुपूरक संहिता फ़ाइल 1 में दिए गए टेम्पलेट के अनुसार इस प्रक्रिया को स्वचालित करने के लिए एक स्क्रिप्ट लिख लें। सॉफ्टवेयर caver 3.0 से 19 आदानों के रूप में 3 डी अंतरिक्ष में गठबंधन किया गया है कि 2.2 से तैयार फोटो (पी डी बी) का प्रयोग करें। फोटो का एक सीमित संख्या के विश्लेषण के लिए, एक मानक कंप्यूटर पर caver चलाते हैं। पानी के अणुओं के परिवहन के लिए विशिष्ट हैं कि सुरंगों का पता लगाने के आश्वस्त करने के लिए 0.7 एक 19 में से एक जांच त्रिज्या का प्रयोग करें। एक आणविक ग्राफिक्स सॉफ्टवेयर में caver 3.0 द्वारा उत्पन्न सुरंगों कल्पना। सुरंगों की आसान दृश्य के लिए, पूरक संहिता Fil में दिखाया गया मैक्रो का उपयोगई 2। सिलिको एंजाइम इंजीनियरिंग में 3. पानी पैटर्न और जल गतिशीलता को संशोधित करने के लिए Caver 3.0 सॉफ्टवेयर से उत्पन्न आउटपुट फ़ाइल "Summary.txt" में सूचीबद्ध शीर्षक "आईडी" के अनुसार सर्वोच्च स्थान सुरंगों को पहचानें। सर्वोच्च स्थान सुरंगों (3.1) और कहा कि प्रदर्शन (2.4 से प्राप्त मॉडल का उपयोग) दृश्य निरीक्षण करके चैनल इंटीरियर की ओर इशारा करते हुए एक छोटा सा पक्ष श्रृंखला अस्तर अमीनो एसिड को पहचानें। "स्वैप अवशेष" कमांड के प्रयोग में वृद्धि हुई steric बाधा से सुरंग रोकेंगे एकल एमिनो एसिड प्रतिस्थापन को पहचानें। सुरंग कदम प्रोटोकॉल का 1.2-3.1 दोहरा द्वारा तो दृश्य निरीक्षण से बाधित है, और सत्यापित करें कि। उत्परिवर्तित जीन 4. अभिव्यक्ति गैर अतिव्यापी प्राइमरों 20 का उपयोग उत्परिवर्तजनन पीसीआर द्वारा जंगली प्रकार के जीन में परिवर्तन का परिचय। ट्यूब के लिए ब्याज की जीन से युक्त प्लास्मिड डीएनए जोड़ेंएक उपयुक्त क्लोनिंग तनाव के सक्षम कोशिकाओं के साथ एस और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। 42 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट तापमान के साथ एक पानी के स्नान में 45 सेकंड के लिए एक गर्मी झटका परिवर्तन कार्य करें। एक ताजा अमीर माध्यम के 500 μl जोड़ें (2YT, 16 जी / एल tryptone, 10 ग्राम / एल खमीर निकालने, 5 ग्राम / एल NaCl) और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, 45 मिनट के लिए 200 आरपीएम। उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक अगर प्लेटों पर बदल कोशिकाओं चढ़ाना द्वारा एक चयन करें। उत्परिवर्तित जीन के डीएनए अनुक्रम पुष्टि करने के बाद, जैसा कि ऊपर वर्णित गर्मी सदमे का उपयोग कर एक अभिव्यक्ति तनाव में प्लास्मिड डीएनए बदलना। झिल्ली बाध्य triterpene cyclases की अभिव्यक्ति के लिए, BL21 (DE3) का उपयोग करें। उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक 2YT मीडिया में अभिव्यक्ति तनाव के 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5 मिलीलीटर हे / एन संस्कृति की शुरुआत करें। 0.05-0.09 के अंतिम ओवर ड्राफ्ट के लिए, उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक 300 मिलीलीटर 2YT-मीडिया वाले, एक 2 एल चकित हिला कुप्पी टीका लगाना (600 एनएम पर मापा जाता है)। 0.6-0 के एक आयुध डिपो में शामिल होने के बाद।8 और प्रोटीन अभिव्यक्ति, -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल गोली और दुकान फ्रीज। एक pD861 वेक्टर में झिल्ली ही सीमित triterpene cyclases के लिए, प्रोटीन 21 की उच्च पैदावार प्राप्त करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 अभिव्यक्ति के मानव संसाधन मिमी rhamnose से 2 और 4 के साथ प्रेरित। एक सामान्य अपकेंद्रित्र और प्रोटीन शुद्धि का उपयोग 5. झिल्ली निकालना निम्नलिखित बफ़र्स तैयार: मेजबान बफर (100 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट, protease अवरोध करनेवाला टैबलेट के साथ पूरक 7.5 पीएच), डिटर्जेंट बफर (1% (वी / वी) ट्राइटन X-100, 50 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट, पीएच 7.5) और प्रतिक्रिया बफर (0.2 % ट्राइटन X-100, 50 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट, पीएच 7.5)। स्क्वैलिन-hopene cyclases या एक कम पीएच इष्टतम के साथ अन्य झिल्ली ही सीमित एंजाइमों के लिए, साइट्रेट के साथ मेजबान बफर में पोटेशियम फॉस्फेट की जगह। डिटर्जेंट बफर (1% ट्राइटन X-100: ऐसे एंजाइमों के लिए निम्नलिखित बफ़र्स का उपयोग, 60 मिमी साइट्रेट, पीएच 6.0) और प्रतिक्रिया बफर (0.2% ट्राइटन एक्स 100, 60 मिमी साइट्रेट, पीएच 6.0)। नोट: एक उनकी टैग शुद्धि के लिए प्रयोग किया जाता है, तो 20 मिमी imidazole (अंतिम एकाग्रता) के साथ मेजबान बफर के पूरक हैं। एक गिलास बीकर में एक जमे हुए सेल गोली वजन। / एमएल 0.3 ग्राम कोशिकाओं के अंतिम एकाग्रता के लिए एक homogenizer का उपयोग मेजबान बफर में कोशिकाओं Resuspend। 80% के एक आयाम और पर 1 सेकंड और 1 सेकंड बंद की एक नाड़ी के साथ ultrasonication द्वारा Lyse resuspended कोशिकाओं। 50 सेकंड प्रत्येक के तीन दोहरा चक्र का प्रयोग करें। 0.2% (वी / वी) डिटर्जेंट की एक अंतिम एकाग्रता के लिए डिटर्जेंट बफर जोड़ें। 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण अंत ओवर के अंत तक संतुलित करना। 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए 39,000 XG पर एक भी centrifugation कदम के बाद सतह पर तैरनेवाला बचाने के द्वारा झिल्ली प्रोटीन अंश की वसूली। नोट: उनकी टैग शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जाता है, तो agarose / जी कोशिकाओं लगभग 1.5 मिलीलीटर नी NTA जोड़ने और 1 घंटे के लिए सेते हैं। पहली बार एक शुद्धि प्रदर्शन करनाआयन एक्सचेंज या उनकी टैग शुद्धि 21 या तो द्वारा कदम है। 0.2% ट्राइटन X-100 के साथ संतुलन और क्षालन बफ़र्स अनुपूरक। शुद्ध प्रोटीन 10 केडीए की कट-ऑफ के साथ केन्द्रापसारक फ़िल्टर इकाइयों का उपयोग कर पांच बार ध्यान लगाओ। नोट: डिटर्जेंट की एक एकाग्रता में ट्राइटन X-100 मिसेलस परिणामों का आकार लगभग 1% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए। । 10 6 × 2 × 10 4 -8 की गोलाकार प्रोटीन के लिए एक विभाजन रेंज के साथ संगत केंद्रित प्रोटीन और एक मैट्रिक्स का उपयोग कर एक जेल निस्पंदन चमकाने कदम से शुद्धि अंतिम रूप देने के बफर चलाने के रूप में प्रतिक्रिया बफर का प्रयोग करें। निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार ब्रैडफोर्ड अल्ट्रा किट का उपयोग करके शुद्ध प्रोटीन की मात्रा को मापने। 6. काइनेटिक्स प्रतिक्रिया बफर में सब्सट्रेट के एक ताजा 5 मिमी स्टॉक समाधान करें। 2-5 मिनट के लिए 30% आयाम पर ultrasonication द्वारा एक समरूप पायस प्राप्त करते हैं। एक thermomixer संतुलित करनावांछित प्रतिक्रिया के तापमान पर। एक बाहरी थर्मामीटर से एक कांच की शीशी युक्त पानी के अंदर के तापमान को सत्यापित करें। एकल सब्सट्रेट कैनेटीक्स के लिए, एक ही अंतिम सब्सट्रेट एकाग्रता के लिए कम से कम पांच कांच की शीशियों में emulsified सब्सट्रेट पतला। कई substrates के साथ एक पॉट रिश्तेदार कैनेटीक्स के लिए, प्रत्येक शीशी में सभी substrates के मिश्रण से कम से कम पांच समान कांच की शीशियों तैयार करते हैं। हाइड्रोफोबिक triterpenes के लिए, 10-200 माइक्रोन की रेंज में अंतिम सब्सट्रेट सांद्रता का उपयोग करें। 10 मिनट के लिए thermomixer में कांच की शीशियों Preincubate। एंजाइम जोड़कर प्रतिक्रिया शुरू करो। 1 मिलीलीटर की कुल प्रतिक्रिया मात्रा उपयुक्त है। कम से कम 1,200 आरपीएम की एक मिलाते हुए गति का प्रयोग करें। 500 μl ethylacetate जोड़कर अलग समय बिंदुओं पर प्रतिक्रियाओं को रोकने के एकीकरण मानक के रूप में 100 माइक्रोन decanol साथ नुकीला। 7. निकालना और thermodynamic विश्लेषण द्वारा प्रतिक्रिया मिश्रण निकालेंvortexing और मैन्युअल 1 मिनट के लिए सख्ती कांच की शीशियों मिलाते हुए। आरटी पर 10 मिनट के लिए एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में 9,600 XG पर कांच की शीशियों अपकेंद्रित्र। एक खाली ट्यूब के लिए ऊपर परत (जैविक चरण) हस्तांतरण। प्रतिक्रिया ट्यूबों के लिए विलायक निष्कर्षण के एक अतिरिक्त 500 μl जोड़ें और निष्कर्षण प्रक्रिया को दोहराने। ना 2 अतः 4 के साथ निकाली गई प्रतिक्रिया मिश्रण सूखी। 5 सेकंड के लिए भंवर और ट्यूबों 10 मिनट के लिए आराम करते हैं। एक तालिका के शीर्ष सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर आरटी पर 1 मिनट के लिए 9,600 XG पर एक अंतिम centrifugation कदम प्रदर्शन करना। गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) शीशियों के लिए निकाले गए नमूने स्थानांतरण। (एकल सब्सट्रेट कैनेटीक्स के लिए) सब्सट्रेट के कम से कम चार अलग अलग प्रारंभिक एकाग्रता और (एकल सब्सट्रेट और प्रतिस्पर्धी कैनेटीक्स दोनों के लिए) चार अलग-अलग तापमान का उपयोग कर, ब्याज की प्रत्येक एंजाइम संस्करण के लिए 6.1-7.2 तहत चरणों को दोहराएँ। पहले से 3 के रूप में वर्णित जीसी विश्लेषण करते हैं। Hydrophob के विश्लेषण के लिए एक गैर-ध्रुवीय स्तंभ का उपयोग करेंआईसी pentacyclic उत्पादों। उत्पादों और स्तंभ पर निर्भर करता है, 120 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रारंभिक ओवन तापमान सेट और 5 डिग्री सेल्सियस / मिनट की एक तापमान ढाल का उपयोग करें। उत्पाद (एस) के शिखर क्षेत्रों को एकीकृत और (100 माइक्रोन के लिए इसी) एकीकरण मानक के क्षेत्र का उपयोग करके इसी उत्पाद सांद्रता में उत्पाद शिखर क्षेत्रों बदलना। प्रतिक्रिया समय (टी) बनाम प्रत्येक उत्पाद ([पी]) की एकाग्रता प्लॉट। कम से कम 10% रूपांतरण करने के लिए इसी डेटा बिंदुओं की रेखीय प्रतिगमन प्रदर्शन करते हैं। प्रारंभिक प्रतिक्रिया की गति (वि 0) के अनुसार फिट लाइन की ढलान द्वारा दिया जाता है: नोट: कई substrates के साथ एक पॉट रिश्तेदार कैनेटीक्स के लिए, वि 0 अन्य substrates के प्रभाव के तहत एक विशेष सब्सट्रेट की प्रारंभिक दर है। एकल सब्सट्रेट कैनेटीक्स, साजिश वी 0 के लिए </suइसी सब्सट्रेट सांद्रता के खिलाफ b> / [ई]। स्पष्ट कश्मीर बिल्ली / कश्मीर मीटर मूल्य के अनुसार ग्राफ के रैखिक भाग का ढाल द्वारा दिया जाता है: [एस] सब्सट्रेट और की एकाग्रता है [ई] परिवर्तन। कश्मीर बिल्ली में इस्तेमाल एंजाइम की एकाग्रता / कश्मीर एम Michaelis लगातार ओवर उत्प्रेरक स्थिर करने के लिए बराबर है। प्रत्येक तापमान और प्रत्येक एंजाइम संस्करण के लिए विश्लेषण दोहराएँ। एकल सब्सट्रेट कैनेटीक्स के लिए, संक्रमण राज्य सिद्धांत 22 के अनुसार एक thermodynamic विश्लेषण प्रदर्शन कश्मीर बी बोल्ट्जमान निरंतर, ज प्लैंक स्थिरांक, टी केल्विन में तापमान है, और गैस निरंतर अनुसंधान। कश्मीर ((एल.एन. की साजिश का एक रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण प्रदर्शन <sयूबी> बिल्ली / कश्मीर एम) / ((कश्मीर बी * टी) / घंटा))) 1 / टी बनाम। सक्रियण तापीय धारिता (Δ एच ‡) (-slope) * आर और सक्रियण एन्ट्रापी (Δ एस ‡) (अवरोधक) * आर द्वारा दिया जाता है द्वारा दिया जाता है। नोट: इसी तरह, saturating सब्सट्रेट एकाग्रता के तहत एक विश्लेषण 3 समीकरण में स्थिर दर के रूप में कश्मीर बिल्ली का उपयोग करके किया जा सकता है। कई substrates के साथ एक पॉट रिश्तेदार कैनेटीक्स के लिए, रिश्तेदार स्पष्ट प्राप्त कश्मीर बिल्ली / 23 से कश्मीर एम मान: (कश्मीर बिल्ली / कश्मीर एम) ए / (कश्मीर बिल्ली / कश्मीर एम) बी वी = 0, ए / वी 0, बी * [बी] / [एक] (4) जो वी 0 के लिए, एक सब्सट्रेट बी के साथ प्रतियोगिता में सब्सट्रेट एक के लिए प्रारंभिक दर को दर्शाता है एक बर्तन रिश्तेदार की के लिएकई substrates के साथ netics, nonlinear प्रतिगमन करके, एक के रूप में संदर्भ की तुलना में, बी के लिए सक्रियण के रिश्तेदार thermodynamic पैरामीटर प्राप्त: सक्रियण तापीय धारिता और संदर्भ परिसर में एक की एन्ट्रापी से सब्सट्रेट बी के लिए पूर्ण सक्रियण मापदंडों की गणना:

Representative Results

एंजाइमी polycyclization कटैलिसीस में पानी की गतिशीलता के महत्व सिलिको विश्लेषण और पता लगाया सुरंगों के बाद के दृश्य में (2 फ़ाइल अनुपूरक कोड में स्क्रिप्ट का उपयोग) से फंसा है। प्रोटोकॉल की धारा 3 के बाद, S168 Alicyclobacillus acidocaldarius से triterpene साइक्लेस एंजाइम में सुरंगों में से एक अस्तर एक "गर्म स्थान" अमीनो एसिड अवशेषों (चित्रा 1, बाएं मध्य) हो पाया है। दृश्य निरीक्षण (चित्रा 1, नीचे बाएँ) के रूप में देखा सिलिको में उत्परिवर्तन S168F को शुरू करके, सुरंग बाधित है। triterpene साइक्लेस एंजाइम द्वारा प्रदर्शित पॉलीसाइक्लिक उत्पादों के गठन के लिए प्रतिक्रिया की दर तापमान (2A चित्रा) के लिए बेहद संवेदनशील है। प्रोटोकॉल (धारा 4-7) के बाद, यह पाया जाता है स्पष्ट कश्मीर बिल्ली / कश्मीर कि <suतापमान 25 डिग्री सेल्सियस (2A चित्रा) द्वारा उठाया जाता है जब b> pentacyclic उत्पादों के गठन के लिए जंगली प्रकार एंजाइम द्वारा प्रदर्शित एम fiftyfold बढ़ जाती है। एक बिंदु उत्परिवर्तन शुरू करने से व्यक्ति सुरंगों को अवरूध्द प्रयोगात्मक निर्धारित निरपेक्ष स्पष्ट कश्मीर बिल्ली / कश्मीर एम मूल्यों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है, साथ ही उनके तापमान निर्भरता (2A चित्रा) पर। प्रयोगात्मक निर्धारित गतिज मापदंडों से, रैखिक thermodynamical भूखंडों समीकरण 3 से और एकल सब्सट्रेट कैनेटीक्स (चित्रा 2 बी) के लिए प्रोटोकॉल की धारा 6-7 निम्न द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं। अवरुद्ध सुरंगों को शरण देने वेरिएंट के लिए मनाया सक्रियण एन्ट्रापी और तापीय धारिता में बहुत बड़े परिवर्तन (चित्रा 2 बी के आधार पर चित्रा -2 सी, गणना) एक प्रमुख polycyclization झरना को बढ़ावा देने में पानी की गतिशीलता के लिए भूमिका निकलता है। अतिरिक्तबदल पानी सुरंगों सक्रियण का बदला हुआ गिब्स मुक्त ऊर्जा प्रदर्शन के साथ, वेरिएंट (Δ जी ‡ = Δ एच ‡ – टी * Δ एस ‡, चित्रा 2 बी-सी)। उदाहरण के लिए, 303 कश्मीर में S168F सुरंग संस्करण जंगली प्रकार एंजाइम के लिए 16 किलो कैलोरी / मोल की तुलना में 14 किलो कैलोरी / मोल की सक्रियता का एक गिब्स मुक्त ऊर्जा को प्रदर्शित करता है। धारा 7 में प्रोटोकॉल के बाद, समीकरण 4 एक पॉट गतिज प्रयोगों से अतिरिक्त substrates (चित्रा 3) के लिए स्पष्ट कश्मीर बिल्ली / कश्मीर एम मूल्यों की गणना के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, एक रेखीय thermodynamic साजिश (3B चित्रा) अलग तापमान (समीकरण 5) में प्रतियोगिता निबंध चलाकर निर्माण किया जा सकता है। एकल सब्सट्रेट कैनेटीक्स को सादृश्य में, एक संदर्भ यौगिक की तुलना में अतिरिक्त substrates के लिए रिश्तेदार सक्रियण तापीय धारिता और एन्ट्रापी readil हैंरेखीय के अवरोधन और ढलान से सुलभ Y प्रयोगात्मक डेटा के लिए फिट बैठता है। सक्रियण के thermodynamic मापदंडों के निरपेक्ष मूल्यों के संदर्भ में यौगिक (समीकरण 6) के साथ जुड़े thermodynamic के डेटा का उपयोग करके अंकगणित अलावा से मूल्यांकन किया जा सकता है। इस के साथ साथ प्रोटोकॉल का उपयोग करना, परिणाम स्पष्ट रूप से अवरुद्ध पानी सुरंगों विभिन्न आकारों (चित्रा 3 सी) के substrates के लिए सक्रियण के मौलिक रूप से अलग thermodynamic पैरामीटर प्रदर्शन के साथ झिल्ली एंजाइम वेरिएंट पता चलता है कि उत्पन्न। चित्रा 1. प्रोटोकॉल सारांश:। प्रयोगात्मक प्रोटीन डिजाइन और thermodynamic विश्लेषण के साथ संगीत कार्यक्रम में सिलिको कंप्यूटर मॉडलिंग में एंजाइम कटैलिसीस पर विलायक गतिशीलता के प्रभाव के एक बढ़ाया समझ के लिए अनुमति देता क्लिक करेंयहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए। एकल सब्सट्रेट कैनेटीक्स से जंगली प्रकार और सुरंग वेरिएंट की सक्रियता का आंकड़ा 2 thermodynamic पैरामीटर। (ए) स्पष्ट कश्मीर बिल्ली / प्रयोगात्मक डेटा से और संक्रमण राज्य सिद्धांत का उपयोग कर समीकरणों 1 और 2 (बी) thermodynamical विश्लेषण का उपयोग करके प्राप्त कश्मीर एम मूल्यों और प्रयोगात्मक डेटा के रैखिक फिट (बी) में भूखंडों से गणना की सक्रियता का 3. (सी) thermodynamic पैरामीटर समीकरण के लिए। prefolded स्क्वैलिन सब्सट्रेट बांड के साथ दिखाया गया है का गठन / बिंदीदार लाइनों के रूप में टूटी हुई है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"> विभिन्न substrates के लिए जंगली प्रकार और सुरंग वेरिएंट की सक्रियता का चित्रा 3. thermodynamic पैरामीटर। (ए) सापेक्ष कश्मीर बिल्ली / समीकरण 4. (बी) का उपयोग करके एक बर्तन कैनेटीक्स से प्राप्त कश्मीर एम मूल्यों अलग से गतिज डेटा की thermodynamical भूखंडों समीकरण 5. (सी) समीकरण 6 से और संदर्भ के रूप में चित्रा 2 में सब्सट्रेट स्क्वैलिन का उपयोग करके गणना की सक्रियता का निरपेक्ष thermodynamic के मापदंडों का उपयोग तापमान। का गठन / substrates में टूट बांड बिंदीदार लाइनों के रूप में दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

जंगली प्रकार झिल्ली एंजाइम और सुरंग वेरिएंट के लिए उच्च गुणवत्ता प्रयोगात्मक thermodynamical डेटा प्राप्त करने में सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: कंप्यूटर मॉडल का 1) पीढ़ी; 2) एक ही ढंग से शुद्ध प्रोटीन; 3) emulsified सब्सट्रेट शेयरों; 4) कैनेटीक्स के दौरान तापमान के नियंत्रण; आंतरिक मानक का उपयोग प्रतिक्रिया मिश्रण का 5) निष्कर्षण।

कंप्यूटर मॉडल की पीढ़ी बहुत प्लेटफार्मों की एक किस्म का समर्थन करता है कि एक उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफेस के साथ एक सॉफ्टवेयर के उपयोग से मदद की है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल भी गैर विशेषज्ञों मॉडलिंग के लिए हमारी रणनीति सुलभ बनाने के लिए YASARA मॉडलिंग सूट ¹⁶ पर आधारित है। पानी सुरंग पहचान के लिए एक कंप्यूटर मॉडल आदर्श ब्याज ²⁴ के एंजाइम की एक क्रिस्टल संरचना पर आधारित होना चाहिए। इस प्रयोजन के लिए प्रोटीन डेटा बैंक में उपलब्ध क्रिस्टल संरचनाओं के धन बहुत फायदेमंद है। हमारे अनुभव, मंदिर के सफल तैयार करने में एक महत्वपूर्ण पहलू मेंसुरंग की पहचान के लिए प्लेटों क्रिस्टेलोग्राफिक पानी रखने के लिए है। यह एक सामान्य कंप्यूटर पर चलाया जा सकता है जो आणविक गतिशीलता सिमुलेशन, जब प्रदर्शन एक solvated एंजाइम बॉक्स का उपयोग करने के लिए समान महत्व का है। Alicyclobacillus acidocaldarius से triterpene साइक्लेस एमडी सिमुलेशन ³ के दौरान पानी में स्थिर है। हालांकि, क्रिस्टेलोग्राफिक डिटर्जेंट रखने और / या कोशिका झिल्ली mimics का उपयोग कर शायद बढ़ाया एमडी सिमुलेशन के लिए अनुमति देने के लिए संभावित अस्थिर एंजाइमों के लिए आवश्यक होगा। यह इस सुरंग संगठन के dynamical पहलुओं पर कब्जा नहीं होगा, हालांकि अत्यधिक चुनौतीपूर्ण लक्ष्य का कम से कम क्रिस्टल संरचना, प्रोटोकॉल का उपयोग महत्वपूर्ण यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है कि कल्पना की है।

एक या इनपुट के रूप में फोटो का एक सीमित संख्या के साथ बुनियादी मोड में caver ^19, एक मानक लैपटॉप पर गैर-विशेषज्ञों द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारे अनुभव ^3, एक टोंटी त्रिज्या के साथ सुरंगों (यानी, त्रिज्या के आधार परसबसे संकीर्ण बिंदु पर) की तुलना में छोटे 1 एक क्रिस्टेलोग्राफिक पानी के अणुओं बाएं मध्य), भविष्यवाणी की सुरंग (चित्रा 1 के भीतर रहते हैं, खासकर अगर पानी के लिए बेहद प्रासंगिक हो सकता है। दूसरी ओर, एक बड़ा टोंटी के दायरे में और सक्रिय साइट ¹⁰ में से सब्सट्रेट के परिवहन के लिए एक सुरंग के संकेत सकता है। अनुपूरक कोड में स्क्रिप्ट 2 भविष्यवाणी की सुरंगों के दृश्य के लिए गैर-विशेषज्ञों द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता करें। भविष्य प्रयोगों अनुरूपता मॉडल पानी के नेटवर्क और गतिशीलता के atomistic अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त रूप से उच्च संकल्प का हो जाएगा कि क्या खोलेगा। साथ और सक्रिय साइट में मौजूद एक ligand के बिना, आणविक गतिशीलता सिमुलेशन प्रदर्शन करने के तरीके पर प्रकाश डालने वाली सुरंग पहचान की प्रक्रिया भी महत्व का होगा प्रभावित करती है।

झिल्ली प्रोटीन की काइनेटिक्स एक दुर्जेय चुनौती ²⁵ गठन कर सकते हैं। प्रोटोकॉल के साथ साथ एक सरल झिल्ली निकासी प्रोटोकॉल पर आधारित हैऐसे ultracentrifuge एक के रूप में महंगे उपकरण, के उपयोग के बिना झिल्ली एंजाइम प्राप्त करने के लिए। एक अंतिम चमकाने कदम के रूप में जेल निस्पंदन के उपयोग के संभावित अवशिष्ट झिल्ली कणों को हटा और एक उचित डिटर्जेंट पर्यावरण ²⁵ को परिभाषित करने के लिए अनुमति देता है।

प्रोटोकॉल से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य गतिज परिणाम प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण पहलू ultrasonication द्वारा सब्सट्रेट शेयर समाधान पायसी करने के लिए है। प्रतिक्रिया बफर में पतला हाइड्रोफोबिक substrates के सरल vortexing inhomogeneous सब्सट्रेट-डिटर्जेंट मिश्रण देता है। गैर emulsified सब्सट्रेट समाधान के pipetting प्रारंभिक दरों का सही निर्धारण को रोकता है जो (मात्रात्मक जीसी द्वारा की पुष्टि की) irreproducible सांद्रता, की ओर जाता है। इसके विपरीत, ठीक से emulsified स्टॉक समाधान की pipetting 0.98-0.99 की सीमा में आर ² के साथ प्रारंभिक दरों के रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण में परिणाम चाहिए। हाइड्रोफोबिक substrates के एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू स्पष्ट सब्सट्रेट घुलनशीलता हैऔर सब्सट्रेट-डिटर्जेंट मिश्रण में उपलब्धता। वास्तव में, यह संदर्भ सब्सट्रेट स्क्वैलिन साथ triterpene साइक्लेस तर करने के लिए संभव नहीं था। इस कारण स्पष्ट कश्मीर _{बिल्ली} के लिए / कश्मीर _एम मूल्यों दोनों बंधन और रसायन शास्त्र से योगदान को शामिल कर सकता है, जो इस के साथ साथ प्रस्तुत कर रहे हैं। हालांकि, यह रसायन शास्त्र कश्मीर _{बिल्ली} के लिए दर सीमित है कि दिखाया गया है / triterpene cyclases ³ द्वारा आयोजित polycyclization झरना के लिए कश्मीर _एम।

यह एक बाहरी थर्मामीटर के साथ एक प्रतिक्रिया कांच की शीशी के अंदर वास्तविक तापमान सत्यापित करने के लिए उच्च महत्व का है। फिर भी, रेखीय फिट बैठता अलग तापमान पर आवश्यक निरंतर स्पष्ट कश्मीर _{बिल्ली} / कश्मीर _एम मूल्यों के साथ वेरिएंट के लिए गरीब हो सकते हैं। यह शून्य (चित्रा 2 बी और 2 सी) के करीब एक सक्रियण तापीय धारिता के साथ S168F संस्करण के साथ साथ (2A चित्रा) के लिए जोर दिया है। बहुत smalस्पष्ट कश्मीर _{बिल्ली} में एल तापमान पर निर्भर परिवर्तन / कश्मीर _एम मनाया सक्रियण एन्ट्रापी में अनिश्चितता उत्पन्न कर सकता Δ एस ^‡ (यानी, चित्रा 2 बी में रैखिक भूखंडों में अवरोधन)। सिद्धांत रूप में, मनाया सक्रियण एन्ट्रापी भी प्रोटीन एकाग्रता को मापने के द्वारा पता लगाया जा नहीं होता है, जो अलग अलग वेरिएंट के लिए सक्रिय एंजाइम, का एक अलग बहुतायत से प्रभावित किया जा सकता है। यह एक बर्तन में कई substrates के मिश्रण जब प्रयोगात्मक त्रुटियों को कम कर रहे हैं कि उम्मीद है। सब अलग substrates इन परिस्थितियों में एंजाइम की एक ही राशि (समीकरण 4) के साथ बातचीत क्योंकि यह है। एक निष्कर्षण विलायक का प्रयोग आंतरिक मानक निकासी और / या जीसी इंजेक्शन के दौरान मतभेद के लिए खाते में करने के लिए महत्वपूर्ण है के साथ नुकीला।

संक्रमण राज्य सिद्धांत को सफलतापूर्वक एंजाइमिकी ²⁶ में इस्तेमाल किया गया है। यह महत्वपूर्ण सैद्धांतिक ढांचा मूलतः डे के गया थागैस चरण में unimolecular प्रतिक्रियाओं के लिए veloped। हालांकि, यह एंजाइमों मुख्य रूप से शास्त्रीय सक्रियण ऊर्जा बाधा ²⁶ को कम करके काम है कि दिखाया गया है। एक के साथ साथ होना मान लिया संचरण गुणांक मापा सक्रियण तापीय धारिता और / या एन्ट्रापी प्रभावित कर सकता है। सुरंग खोदने का योगदान है, और इस तरह के संक्रमण राज्य recrossing के रूप में अन्य गैर शास्त्रीय प्रभाव, मोटे तौर पर ऊर्जा के क्षेत्र में लगभग 4 किलो कैलोरी / मोल के लिए इसी कटैलिसीस ²⁶ को 1,000 गुना योगदान कर सकते हैं। यह (328 कश्मीर, चित्रा -2 में 16 किलो कैलोरी / मोल) जंगली प्रकार एंजाइम द्वारा प्रदर्शित सक्रियण एन्ट्रापी एक गैर वर्दी संचरण गुणांक की वजह से इस तरह के गैर-शास्त्रीय प्रभाव से भी बड़ा है कि देखा जा सकता है। प्रोटोकॉल का उपयोग जंगली प्रकार और सुरंग वेरिएंट के लिए सक्रियण की thermodynamic पैरामीटर की तुलना करते समय संचरण गुणांक के प्रभाव को कम करना चाहिए।

सक्रियण की गिब्स मुक्त ऊर्जा (Δ जी ^‡) कम्पो हैएक enthalpic (Δ एच ^‡) और एक entropic दोनों की एसईडी (- टी * Δ एस ^‡) शब्द। कटैलिसीस के दौरान एंजाइमों में विलायक पुनर्गठन दोनों मानकों को प्रभावित कर सकते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल आवश्यक biophysical प्रयोगात्मक ढांचे के साथ प्रासंगिक और सिलिको में उपयोगकर्ता के अनुकूल कम्प्यूटेशनल उपकरण का एक साधन कोडांतरण द्वारा इन घटनाओं के अध्ययन की सुविधा होने की उम्मीद है। विधि झिल्ली ही सीमित एंजाइमों द्वारा कटैलिसीस सहित एंजाइमी प्रक्रियाओं, की अधिकता के अध्ययन के लिए उपयोगी होने की परिकल्पना की गई है।

Materials

YASARA	YASARA Biosciences	http://www.yasara.org/	Molecular modeling and simulation program
CAVER	CaverSoft	http://caver.cz/	Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use
Bradford Ultra	Expedeon	BFU1L, BFU05L	Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent
Potter-Elvehjem homogenizer	VWR	432-0205, 432-0217	Homogenization of frozen cell pellet
Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	4693159001	Protease inhibitor
Centrifugal Filter Units	Millipore	UFC901008	Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa
Thermomixer	Eppendorf	5382000015	Thermomixer for sample incubation