Kanaler for transport av vannmolekyler i enzymer påvirker aktive sete solvatering og katalyse. Heri presenterer vi en protokoll for prosjektering av disse ekstra katalytiske motivene basert på in silico datamodellering og eksperimenter. Dette vil øke vår forståelse av påvirkning av løsemiddel dynamikk på enzymkatalyse.
Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.
Vann utgjør en hjørnestein for kjemien i livet en. Vann mønstre og solvatering av enzym aktive seter påvirke både entalpi og entropi av ligandbinding 1,2 og katalyse 3 i en svært komplisert måte strekker seg utover den hydrofobe effekten 2,3. NMR 4, har kalorimetri 2 og molekylær modellering av solvaterte proteiner blitt brukt til å kaste lys over den rollen eksplisitte vannmolekyler i å gi en drivkraft for ligand forening 5-8, spesifisitet og aktivitet 2,9,10. Heri presenterer vi en unik metode for den eksperimentelle vurdering av termodynamiske virkningen av løsningsmiddel forskyvning av enzymkatalyse (figur 1). Vår samlede strategi er basert på bruk av datasimulering i konsert med enzym engineering og termodynamisk analyse (figur 1). Dette åpner for å kaste ytterligere lys over virkningen av løsemiddel dynamikk på catalysis, som for tiden er dårlig forstått.
Stabiliserende entalpiske interaksjoner, levert av vann-mediert hydrogenbindinger i solvatisert enzym aktive nettsteder, kan bli motvirket av entropiske straffer 1. Disse entropiske kostnadene er knyttet til reduksjon i antall frihetsgrader som vises av vannmolekyler innestengte hulrom innenfor protein, sammenlignet med vann i bulk 5. Utgivelsen av bestilte vannmolekyler kan dermed gi en entropic pådriver for ligand foreningen en og katalyse tre. Et viktig aspekt av løsemiddel dynamikk er forskyvningen av vannmolekyler mellom det indre av proteiner og utvendig løsningsmidlet 4. De etterfølgende endringer i aktiveringsenergien, entalpi og entropi 11 ikke er fullstendig forstått på det molekylære nivå. Ved å hindre enkelte tunneler med ansvar for transporten av vann i enzymer, viktigheten av løsemiddel dynamikk og dens bidrag til aktiveringsenergi kan evalueres (figur 1). Dessuten, ved å utføre en-pottekinetiske eksperimenter ved forskjellige temperaturer, de relative termodynamiske aktiveringsparametrene til flere substrater kan ekstraheres fra et redusert antall eksperimenter (figur 1, til høyre). Vårt tverrfaglige metoden er validert for komplekse membranbundne triterpene syklase enzymer som genererer polysykliske terpener av høy viktighet for livet 12. Protokollen muliggjør utvinning av store mengder membranprotein (10-20 mg / l) ved hjelp av en standard sentrifuge.
Selv om enzymer utviklet seg i vann, er rollen som løsningsmiddel for å fremme katalyse vanligvis neglisjert. I tillegg til protein dynamikk 13,14 at formen pre-organiserte aktive områder med elektro komplementaritet til overgangen staten 15, kan vann dynamikk være av stor betydning for effektiv enzymkatalyse. Ved å smi en rekke tverrfaglige teknikker, vårMålet er å legge til rette for svært komplekse undersøkelse av vanndynamikk og termodynamikk. Å gjøre disse verktøyene mer tilgjengelig for det vitenskapelige samfunnet vil føre til utvikling av nye strategier i enzym engineering og protein design for endrede aktiviteter og særegenheter.
De mest kritiske trinn i å oppnå høy kvalitet på eksperimentelle termodynamiske data for villtype-enzym, og membranen tunnel varianter er: 1) generering av datamodellen; 2) homogent rensede proteiner; 3) emulgert substrat aksjer; 4) kontroll av temperaturen under kinetikk; 5) ekstraksjon av reaksjonsblandinger ved hjelp av intern standard.
Generering av datamodellen er sterkt lettere ved bruk av en programvare med et brukervennlig grensesnitt som støtter en rekke plattformer. Derfor er denne protokollen forut på YASARA modellering suite 16 for å gjøre vår strategi tilgjengelig selv å modellere ikke-eksperter. En datamaskinmodell for vanntunnel identifikasjon bør ideelt sett være basert på en krystallstruktur av enzymet av interesse 24. For dette formål er den mengde krystallstrukturer er tilgjengelig i proteindatabanken meget gunstig. Vår erfaring er et viktig aspekt i vellykket utarbeidelse av templater for tunnel identifikasjon er å holde krystallografiske farvann. Det er like viktig å bruke en solvatisert enzym boksen når du utfører molekylær dynamikk simuleringer, som kan kjøres på en vanlig datamaskin. Triterpene cyclase fra Alicyclobacillus acidocaldarius er stabilt i vannet under MD simuleringer 3. Men å holde krystallografiske detergenter og / eller ved hjelp av cellemembranligner vil kanskje være nødvendig for potensielt ustabile enzymer for å tillate utvidet MD simuleringer. Man kan tenke seg at den minimalisert krystallstrukturen av svært utfordrende mål kan gi viktig innsikt mekanistisk ved anvendelse av protokollen, selv om dette ikke ville fange dynamiske sider av tunnelen organisasjon.
Caver 19 i standardmodus, med en enkelt eller et begrenset antall bilder som input, kan brukes av ikke-eksperter på en standard bærbar PC. Basert på vår erfaring 3, tunneler med en flaskehals radius (dvs. radiuspå det smaleste punkt) som er mindre enn 1 Å kan være svært relevant for vann, spesielt hvis krystallografiske vannmolekyler ligge innenfor den forutsagte tunnel (figur 1, midtre venstre). På den annen side kan en større radius flaskehals innebære en tunnel for transport av substratet i og ut av det aktive sete 10. Skriptet i Tilleggskode fil 2 kan brukes av ikke-eksperter for visualisering av predikerte tunneler. Senere eksperimenter vil vise om homologi modeller vil være av tilstrekkelig høy oppløsning for å tillate atomistisk studiet av vann nettverk og dynamikk. Belyse hvordan utføre molekylære dynamikk simuleringer, med og uten en ligand er til stede i det aktive setet, påvirker prosessen med tunnelen identifikasjon vil også være av betydning.
Kinetics av membran proteiner kan utgjøre en formidabel utfordring 25. Protokollen her er basert på en enkel membran utvinning protokollenfor å få membranen enzymet uten bruk av kostbart utstyr, slik som en ultrasentrifuge. Bruken av gelfiltrering som en avsluttende polering trinnet fjerner eventuelle rester av membran-partikler og gir mulighet for å definere et passende vaskemiddel 25 miljø.
Et viktig aspekt i å oppnå reproduserbare kinetiske resultater fra protokollen er å emulgere underlaget stamløsning av ultralyd. Enkel virvling av hydrofobe substrater fortynnes i en reaksjonsbuffer gir inhomogene blandinger av substrat-detergent. Den pipettering av ikke-emulgert substrat løsninger fører til uforklarlige konsentrasjoner (bekreftet ved kvantitativ GC), noe som hindrer nøyaktig bestemmelse av innledende priser. I motsetning til dette, bør det pipettering av riktig emulgerte stamløsninger medføre lineær regresjonsanalyse av innledende priser med R2 i området fra 0,98 til 0,99. Et annet viktig aspekt av hydrofobe substrater er den tilsynelatende substratet oppløselighetog tilgjengelighet i blandingene substrat-vaskemiddel. Faktisk var det ikke mulig å mette triterpene cyclase med referanse substratet squalen. Av denne grunn tilsynelatende k cat / K M Verdiene er angitt heri som kan inneholde bidrag fra både bindende og kjemi. Imidlertid har det vist seg at kjemien er hastighetsbegrensende for k cat / K M for polycyclization kaskade utført av triterpene cyclases 3.
Det er av stor viktighet for å bekrefte den virkelige temperatur i et reaksjonshetteglass med en ekstern termometer. Likevel kan lineære fits være dårligere for varianter med essensiell konstant tydelig k cat / K M verdier ved forskjellige temperaturer. Dette understrekes av den S168F varianten heri (figur 2A) med en aktiverings entalpien nær null (figur 2B og 2C). Veldig small temperaturavhengige endringer i tilsynelatende k cat / K M, kan indusere usikkerhet i den observerte aktivering entropi Δ S ‡ (dvs. skjærings i de lineære plott i figur 2B). I prinsippet kan den observerte aktiverings entropi også påvirkes av en annen mengde av aktive enzymer til forskjellige varianter, som ikke ville bli detektert ved måling av proteinkonsentrasjonen. Det er forventet at forsøksfeil reduseres ved blanding av flere substrater i en pott. Dette skyldes at alle de forskjellige substrater samvirke med den samme mengde enzym under disse forhold (ligning 4). Anvendelsen av et ekstraksjonsløsningsmiddel tilsatt en intern standard er viktig å ta hensyn til forskjeller i løpet av ekstraksjon og / eller GC-injeksjon.
Transition state teorien har blitt brukt i Enzymology 26. Denne viktige teoretiske rammeverket ble opprinnelig DEklet for unimolecular reaksjoner i gassfasen. Imidlertid har det vist seg at enzymer i hovedsak virker ved å senke den klassiske aktiveringsenergibarrieren 26. Transmisjonskoeffisienten antas å være en heri vil kunne påvirke de målte aktiverings entalpi og / eller entropi. Bidraget av tunnel, og andre ikke-klassiske effekter som recrossing av overgangstilstanden, kan bidra med omtrent 1000 ganger for å katalyse 26 svarende til omtrent 4 kcal / mol i energi. Det kan sees at aktiveringen entropi som vises av villtype-enzymet (16 kcal / mol ved 328 K, figur 2C) er mye større enn slike ikke-klassiske effekter forårsaket av en ikke-ensartet transmisjons koeffisient. Virkningen av transmisjonskoeffisienten bør avta når man sammenligner termodynamiske parametre for aktivering av villtype og tunnel-varianter ved hjelp av protokollen.
Gibbs fri energi for aktivering (Δ G ‡) er composed av både en entalpisk (Δ H ‡) og en entropic (- T * Δ S ‡) sikt. Solvent omorganisering i enzymer under katalyse kan påvirke begge parametrene. Det forventes protokoll til rette studiet av disse fenomenene ved å samle en verktøykasse av relevante og brukervennlige i silico dataverktøy med nødvendig biofysiske eksperimentelle rammeverk. Fremgangsmåten er tenkt å være nyttig for å studere en mengde enzymatiske prosesser, inkludert katalyse av membranbundne enzymer.
The authors have nothing to disclose.
The Swedish Research Council (VR) is greatly acknowledged for financial support of this work by a young investigator grant #621-2013-5138. The PDC Center for High Performance Computing at the KTH Royal Institute of Technology is acknowledged for providing computational support.
YASARA | YASARA Biosciences | http://www.yasara.org/ | Molecular modeling and simulation program |
CAVER | CaverSoft | http://caver.cz/ | Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use |
Bradford Ultra | Expedeon | BFU1L, BFU05L | Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent |
Potter-Elvehjem homogenizer | VWR | 432-0205, 432-0217 | Homogenization of frozen cell pellet |
Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor |
Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC901008 | Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa |
Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer for sample incubation |