Enzimler su moleküllerinin taşınması için kanallar aktif bölge solvasyonu ve kataliz etkilemektedir. Bu yazıda siliko bilgisayar modellemesi ve deneylerde dayanarak bu ek katalitik motiflerin mühendislik için bir protokol mevcut. Bu enzim kataliz üzerindeki çözücü dinamiklerin etkisi anlayışımızı artıracaktır.
Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.
Su yaşam 1 kimyasının bir taşını oluşturmaktadır. Su desenleri ve enzim aktif sitelerin çözme entalpisi ve hidrofobik etkisi 2,3 ötesine uzanan oldukça karmaşık bir şekilde 1,2 ve kataliz 3 ligand entropi hem de etkiler. NMR 4, kalorimetre 2 ve çözünmüş proteinlerin moleküler modelleme ligand dernek 5-8, özgüllük ve aktivite 2,9,10 için itici bir kuvvet sağlayan açık su moleküllerinin rolüne ışık tutacak için kullanılır olmuştur. Bu yazıda Enzim kataliz üzerindeki çözücü deplasman termodinamik etkisi (Şekil 1) deneysel değerlendirilmesi için eşsiz bir metodoloji sunuyoruz. Bizim kombine strateji enzim mühendisliği ve termodinamik analizi (Şekil 1) ile uyum içinde bilgisayar simülasyonları kullanarak dayanmaktadır. Bu cata üzerine çözücü dinamiklerin etkisi ek aydınlatan sağlarŞu anda tam olarak anlaşılamamıştır parçalama.
Çözünmüş enzim aktif sitelerde su aracılı hidrojen bağları tarafından sağlanan enthalpic etkileşimleri, stabilize, entropik cezalar 1 mahsup edilebilir. Toplu 5 su ile karşılaştırıldığında bu entropik maliyetler protein boşlukları içinde kalan su molekülleri tarafından görüntülenen serbestlik derecesi azalma ile ilişkilidir. Sipariş su moleküllerinin serbest bırakma ve böylece ligand dernek 1 ve kataliz 3 için entropik itici gücünü sağlayabilir. Solvent dinamiklerinin önemli bir yönü proteinlerin iç ve dış solvent 4 arası su moleküllerinin değiştirmesidir. Aktivasyon enerjisi, entalpi, entropi ve 11 İlişikteki değişiklikler tamamen moleküler düzeyde anlaşılmış değildir. Aktivasyonuna enzimlerin suyun taşınması, çözücü dinamikleri önemi ve katkılarından dolayı sorumlu bireysel tüneller engelleyerekEnerji (Şekil 1) değerlendirilebilir. Ayrıca, farklı sıcaklıklarda tek kap kinetik deneyler yaparak çeşitli alt tabakaların göreli termodinamik aktivasyon parametreler, deneylerin sayısı azaltılmış (Şekil 1, sağ) elde edilebilir. Bizim disiplinlerarası yöntem ömrü 12 yüksek öneme sahip polisiklik terpenler oluşturmak karmaşık zara bağlı triterpen siklaz enzimleri onaylanmıştır. Protokol, standart bir santrifüj kullanılarak membran proteini yüksek miktarda (10-20 mg / L) geri kazanımını sağlar.
Enzimler, su gelişti rağmen, kataliz teşvik çözücü rolü genellikle ihmal edilir. Şekil geçiş durumuna 15 elektrostatik tamamlayıcılık aktif siteler önceden organize protein dinamikleri 13,14 ek olarak, su dinamiği, verimli enzim kataliz için yüksek öneme sahip olabilir. Birkaç disiplinlerarası teknikleri dövme, bizimAmaç su dinamikleri ve termodinamiğin son derece karmaşık bir çalışma kolaylaştırmaktır. Bilimsel topluluk bu araçları daha erişilebilir hale değişmiş faaliyetleri ve özellikleri için enzim mühendisliği ve protein tasarımında yeni stratejilerin geliştirilmesine yol açacaktır.
Yabani tip membran enzimi ve tünel varyantlar için yüksek kaliteli, deneysel termodinamik verileri ulaşmada en kritik adımlar şunlardır: Bilgisayarınızın modeline 1) nesil; 2) homojen saflaştırılmıştır proteinler; 3) emülsifiye substrat stokları; 4) kinetik sırasında sıcaklığın kontrolü; Iç standart kullanılarak tepkime karışımlarından 5) elde edilmesi.
Bilgisayar modeli nesil ölçüde platformlarda çeşitli destekler kullanıcı dostu arayüzü ile bir yazılımın kullanımı kolaylaştırılmıştır. Dolayısıyla, bu protokol bile olmayan uzmanlar modelleme bizim strateji erişilebilir hale getirmek için YASARA modelleme paketi 16 yapılanır. Su tüneli tanımlanması için bir bilgisayar modelinin, ilgi 24 enzimin bir kristal yapısı dayanmalıdır. Bu amaç için, protein veri bankası uygun kristal yapılarının zenginliği çok faydalıdır. Bizim deneyim, tem başarılı hazırlanmasında önemli bir yönüyleTünel tanımlanması için plakalar kristalografik suları tutmaktır. Bu normal bir bilgisayarda çalıştırılabilir moleküler dinamik simülasyonları, yaparken bir çözülmüş enzim kutusunu kullanın eşit öneme sahiptir. Alicyc acidocaldarius gelen triterpen siklaz MD simülasyonları 3 esnasında su stabildir. Bununla birlikte, kristalografik deterjanlar tutmak ve / veya hücre membranı taklit eder kullanılarak belki de uzun bir MD simülasyonlar için izin vermek için potansiyel olarak kararsız enzimler için gerekli olacaktır. Bu tünel örgütün dinamik yönlerini ele olmaz, ancak son derece zorlu hedeflerin minimize kristal yapısı, protokolü kullanılarak önemli mekanik fikir verebilir öngörülmektedir.
Tek veya girdi olarak anlık sınırlı sayıda temel modda Caver 19, standart bir dizüstü bilgisayarda olmayan uzmanlar tarafından da kullanılabilir. Bizim deneyim 3, bir darboğaz yarıçaplı tüneller (yani, yarıçap dayanaraken dar noktasında) 1'den küçük Å kristalografik su molekülleri sol orta), tahmin edilen tünelin (Şekil 1 içinde ikamet, özellikle su son derece alakalı olabilir. Diğer yandan, daha büyük bir dar boğaz çapı ve aktif sitenin 10 üzerinden alt-tabakanın taşınması için bir tünel anlamına gelebilir. Tamamlayıcı Kodu komut 2. öngörülen tünellerin görünüm için olmayan uzmanlar tarafından kullanılabilir Dosya. Gelecek deneyler homoloji modelleri, su şebekeleri ve dinamikleri atomistik çalışma için izin yeterince yüksek çözünürlük olup olmayacağını ortaya koyacaktır. Ve aktif bölgede bulunan bir bağ olmadan, moleküler dinamik simülasyonları performans nasıl ışık tutan, tünel tanımlama süreci de önemli olacağını etkiler.
Membran proteinlerinin Kinetik zorlu bir 25 teşkil edebilir. Protokol, burada basit bir zar çıkarma protokolüne dayalıörneğin, bir ultra santrifüj gibi pahalı ekipman kullanılmaksızın membran enzim elde edildi. Son cilalama aşaması olarak jel filtrasyonu kullanımı potansiyeli artık zar partikülleri temizler ve uygun bir deterjan ortamı 25 tanımlamak için izin verir.
Protokolden tekrarlanabilir kinetik sonuçlar elde önemli bir yönü ultrasonication substrat stok çözelti emülsifiye etmektir. Reaksiyon tampon maddesi içinde seyreltilmiş, hidrofobik yüzeylere basit vorteksleme homojen olmayan alt tabaka, deterjan karışımları vermektedir. Olmayan emülsifiye edilmiş alt-tabaka çözeltilerinin pipetleme başlangıç hızları doğru belirlenmesini önler (kantitatif GC ile teyit) 'tekrarı konsantrasyonlarına yol açar. Buna karşılık, doğru emülsiyon haline Stok çözeltilerin pipetleme 0.98-0.99 aralığında R 2 ile başlangıç hızları lineer regresyon analizi ile sonuçlanmalıdır. Hidrofobik alt-tabakaların bir diğer önemli yönü görünür substrat çözünürlüğüdürve alt tabaka-deterjan karışımlarında kullanılabilirlik. Aslında, bu referans substrat skualen ile Triterpen siklaz doyurmak mümkün değildi. Bu nedenle belirgin k kedi / K M değerleri hem bağlayıcı ve kimya katkıları içerebilir hangi burada sunulmuştur. Ancak, kimya k kedi için sınırlayıcı hızı olduğu görülmüştür / triterpen siklazlar 3 tarafından yürütülen polycyclization kaskad K M.
Harici bir termometre ile bir reaksiyon cam bir şişe içindeki gerçek sıcaklık kontrol etmek için büyük önem taşımaktadır. Yine de, doğrusal uyan farklı sıcaklıklarda temel sabit görünen k cat / K M değerlerine sahip varyantlar için kötü olabilir. Bu sıfır (Şekil 2B ve 2C) yakın bir aktivasyon entalpisi ile S168F varyantı burada (Şekil 2A) için olduğunu vurguladı. Çok smalbelirgin k kedi l sıcaklığa bağlı değişimleri / K M, gözlenen aktivasyon entropi belirsizlik neden olabilir Δ S ‡ (yani, Şekil 2B'de doğrusal araziler kesişimi). Prensip olarak, gözlemlenen aktivasyon entropi aynı zamanda protein konsantrasyonu ölçülerek tespit olmaz farklı türevleri aktif enzim, farklı bir bolluk etkilenebilir. Bu tek bir kapta birden fazla alt-tabakaların karıştırırken deneysel hatalar azaltılır beklenmektedir. Farklı alt-tabakalar, bu, tüm koşullar altında enzim aynı miktarda (denklem 4) ile etkileşim olmasıdır. Bir ekstraksiyon çözücünün kullanımı, bir iç standart ekstre etme ve / veya GC-enjeksiyon sırasında farklılıkları hesaba önemlidir ile çivili.
Geçiş devlet teorisi başarıyla enzimoloji 26 kullanılmıştır. Bu önemli teorik çerçeve başlangıçta de oldugaz fazında tek moleküllü reaksiyonlar için veloped. Bununla birlikte, enzimlerin çoğu klasik aktivasyon enerji bariyerini 26 düşürerek çalışması gösterilmiştir. Tek, burada olduğu varsayılır iletim katsayısı ölçülen aktivasyon entalpisi ve / veya entropi etkileyebilir. Tünel katkısı ve bu geçiş halinin recrossing gibi diğer klasik olmayan etkiler, kabaca enerjide yaklaşık 4 kcal / mol tekabül kataliz 26 1000 kat katkıda bulunabilirsiniz. Bu (328 K, Şekil 2C, 16 kcal / mol), vahşi tip enzimin tarafından görüntülenen aktivasyon entropi muntazam olmayan bir aktarım katsayısı nedeniyle örneğin klasik olmayan etkileri çok daha büyük olduğu görülebilir. Protokolünü kullanarak vahşi tip ve tünel türevleri için aktivasyon termodinamik parametreleri karşılaştırırken iletim katsayısının etkisi azaltmak gerekir.
Aktivasyon Gibbs serbest enerjisi (Δ G ‡) bileşim olupBir enthalpic (Δ H ‡) ve Entropic hem sed (- T * Δ S ‡) terim. Kataliz sırasında enzimlerin Solvent yeniden yapılanma hem parametreleri etkileyebilir. Mevcut protokol gerekli biyofiziksel deneysel çerçeve ile ilgili ve silico kullanıcı dostu hesaplama araçları araç kutusu monte ederek bu olayların incelenmesini kolaylaştırmak bekleniyor. Yöntem, membrana bağlı enzimler ile kataliz içeren enzimatik yöntemlerle, bir bolluk çalışmak için faydalı olduğu düşünülmektedir.
The authors have nothing to disclose.
The Swedish Research Council (VR) is greatly acknowledged for financial support of this work by a young investigator grant #621-2013-5138. The PDC Center for High Performance Computing at the KTH Royal Institute of Technology is acknowledged for providing computational support.
YASARA | YASARA Biosciences | http://www.yasara.org/ | Molecular modeling and simulation program |
CAVER | CaverSoft | http://caver.cz/ | Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use |
Bradford Ultra | Expedeon | BFU1L, BFU05L | Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent |
Potter-Elvehjem homogenizer | VWR | 432-0205, 432-0217 | Homogenization of frozen cell pellet |
Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor |
Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC901008 | Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa |
Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer for sample incubation |