Endosomolytic 시약 dfTAT와 배양 라이브 세포에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 ​​분자의 배달

요약

우리는 단백질과 세포 불투과성 소분자를 배양된 포유류 세포에 전달하는 방법을 내포세포 소기관을 누출시키는 시약과 함께 간단한 공동 배양 프로토콜

로 설명합니다.

초록

고분자 배달 전략은 일반적으로 세포 항목의 경로로 세포 내 이입 경로를 사용합니다. 하지만, 엔도 좀 포획 심각 세포 세포질 공간에 침투 고분자의 효율성을 제한한다. 최근에는 시약 dfTAT, 형광 물질로 표지 된 테트라 메틸 TAT 펩타이드의 이황화 결합의 이량 체를 식별하여이 문제를 회피하고있다. 우리는 생균을 관통하고, 특히 고효율로 세포의 세포질 공간에 도달 원형 세포 투과 펩티드 (CPP) TAT, dfTAT의 형광 표지 된 이량 체를 생성 하였다. dfTAT의 시토 졸 전달은 일차 세포를 포함한 여러 세포주에서 얻어진다. 또한, 배달 띄게 세포 생존, 증식 또는 유전자 발현에 영향을주지 않는다. dfTAT는 소분자, 펩티드, 항체, 효소 및 생물학적 활성 전사 인자를 전달할 수있다. 이 보고서에서 우리는 DFTA에 포함 된 프로토콜을 설명T 합성 및 세포 배달. 원고는 세포 외로 투여 된 단백질의 양을 변화시켜 세포의 세포질 공간으로 전달 단백질의 양을 제어하는​​ 방법을 설명합니다. 마지막으로,이 새로운 기술 및 배달 검증에 관련된 단계의 현재 제한이 논의된다. 설명 된 프로토콜은 세포 기반 분석법뿐만 아니라 세포의 생체 외 조작 및 리 프로그래밍에 매우 유용 할 것이다.

서론

생균에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 분자의 전달은 많은 생물 또는 생물 공학적 응용 (셀룰러 이미징 기능 분석, 세포 리 프로그래밍, 등.) ^1-4에 종종 바람직하다. 다수의 전달 방법은 이미 미세 주입, 전기 천공, 또는 운반 제의 사용을 포함하여,보고되고있다 (예., 예컨대 TAT 같은 세포 투과 펩티드, 지질) ^5-7. 각 기술은 일반적으로 특정 응용 프로그램에 대한 아니라 다른 사람에 대한 이러한 접근 방식이 적절 할 수있는 특정 장단점이 있습니다. 일반적인 문제는 소수의 세포가 아니라 전체 인구 및 / 또는 부족 ^8,9 전달 얼마나 많은 물질의 제어, 독성 또는 해로운 생리 학적 영향 ^{10, 11,} 시간 제어의 부족, 배달의 가난한 전달 효율을 (포함 예 :., 마이크로 인젝션) ⁽¹²⁾ 및 복소 공액 또는 화학적 제제 스킴 ^11.

S = "jove_content은"> 최근에, 우리는 이러한 한계를 우회하는 새로운 배달 전략을 개발했다. 이 전략은 dfTAT라는 펩타이드 (이량 체 형광 TAT) ^(13)에 의존한다. dfTAT는 잘 알고 세포 침투 펩타이....

프로토콜

1. SPPS : CK (TMR) TATG (fTAT) 합성

주 : dfTAT는 두 단계로 생성된다 : dfTAT을 형성하는 디설파이드 결합 이량이어서 고상 펩티드 합성에 의해 모노머의 합성을 fTAT.

1. 1 시간 동안 50 ml의 표준 SPPS 용기에서 디메틸 포름 아미드 (DMF)에 링크 아미드 MBHA 수지 500 mg의 팽창.
2. . 20 % 피 페리 딘 용액 (DMF 중 20 % 피 페리 딘 10 ㎖ (0.30 밀리몰)에서의 Fmoc 보호 된 수지를 배양함으로써 및 Fmoc 탈 보호를 수행하여 (1 X 5 분 및 세정 공정으로 1 × 15 분)을 사용하여 두 번 탈 보호 단계를 수행 DMF는 (세정 공정은 DMF 약 150 ml의 총 부피로 수지를 여러 번 세척하고, 진공 여과에 의해 용매를 제거하는 단계를 포함) 사이의 반응.
3. 링크 아미드 MBHA 수지에 CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT)를 합성. 사용의 Fmoc 아미노산 보호 다음의 Fmoc-리스 (MTT) -OH (만​​ N- 말단에)의 Fmoc-리스 (BOC)를 -OH,의 Fmoc-의 Gly-OH,의 Fmoc, 인수 (PBF) -OH,의 Fmoc- GLN (Trt가) -OH, Fmoc 등-개의 Cys (Trt가....

결과

fTAT dfTAT과의 차이를 평가하기 위해, HeLa 세포들은 세포 지역화의 차이를 결정하기 위해 각각의 펩타이드로 1 시간 동안 배양 하였다. 두개의 CPP의 내재화를 형광 현미경을 사용하여 평가 하였다. fTAT (20 μM)은 점상 분포에 편재 2는 도표. 펩타이드는 엔도 좀 내부에 갇힌 나머지이 분포는 일치한다. 대조적으로, dfTAT (5 μM)의 형광 신호는 세포질 및 핵 걸쳐 균일 분포를 표시한다.도 3을 dfTAT의 세포질 분포 COLO 316, NIH 3T3,는 HaCaT 포함한 다른 세포주의 수에서 관찰되는 것을 나타낸다 신경-2A, MCH58, 일차 전지 라인 HDF를 형질하기 어려운, DRG-F11 및 NCL-H1299. 20X 이미지는 접시에 매우 높은 비율 (> 80 %) (더 SYTOX 블루 핵 stainin없는 세포 독성 dfTAT의 세포질 분포를 표시하지 보여줍니다G).

dfTA.......

토론

사람이 지나치게 합류 안된다 dfTAT 전달을 위해 사용되는 세포 (> 90 % 컨 플루 언시)을 전달 효율에 영향을 미칠 수도있다. 세포는 건강해야한다 : 문화의 죽은 세포는 dfTAT이 (저하 핵에서 예를 들어, DNA)을 상호 작용할 수있는 세포 사멸 조각을 해제 할 수 있습니다. 차례로이 전달 효율과 영상의 품질을 방해 할 수 있습니다. 세포 dfTAT를 추가하기 전에 FBS를 제거하기 위해 철저하게 세척해야합니다. FBS에서 BSA의 존재 dfTAT에 결합 할 수 있으며이 dfTAT의 전달 효율을 낮출 수 있습니다. 세척은 그러나 자기편 세포가 배양 접시에서 분리 또는 uptake.When이 단백질 / 펩타이드 원액 샘플이 충분히 있어야한다 dfTAT를 사용하여 단백질 / 펩타이드를 제공 낮은 세포 내 이입 결과 스트레스의 원인이 될 수 있습니다주의 과도한 힘으로 수행되어야한다 200 μ에 시료 10 μL - 5에 추가, 예를 들면 : 배양 동안 NRL-15 미디어의 과도한 희석을.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
헤파린	Sigma	CAS 9041-08-1
SYTOX Blue	Invitrogen	S11348
SYTOX Green	Invitrogen	S7020
nrL15 L-15 (–) cysteine	Hyclone		특별 주문
Fmoc-protected 아미노산	Novabiochem
dfTAT			샘플은 요청 시 제공됩니다(연락처: pellois@tamu.edu)
Biosafety Cabinet
Inverted epifluorescence microscope	Olympus	모델 IXB1	37°C로 유지되는 가열 스테이지를 갖추고 있습니다. C 및 Rolera-MGI Plus 이면조사형 전자 증식 전하 결합 소자(EMCCD) 카메라(Qimaging)가 있습니다.
37 &도; C 가습, 5% CO2 인큐베이터
펩타이드 합성기 또는 수동 펩타이드 합성

은 을 예비하기 위한 용기