エンドソーム溶解試薬dfTATとのインキュベーションによって生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不浸透性小分子の送達
Summary
We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.
Abstract
高分子送達戦略は、典型的には、細胞侵入経路としてエンドサイトーシス経路を利用します。しかし、エンドソーム捕捉が大幅に細胞の細胞質ゾル空間を貫通巨大分子れる効率を制限します。最近、我々は、試薬dfTAT、蛍光体テトラメチルローダミンで標識されたペプチドTATのジスルフィド結合二量体を識別することによって、この問題を回避しています。我々は、生細胞に浸透し、特に高い効率で細胞の細胞質ゾル空間に到達した原型の細胞透過性ペプチド（CPP）、TAT、dfTATの蛍光標識された二量体を生成しました。 dfTATのサイトゾル送達は初代細胞を含む複数の細胞株において達成されます。また、配達は著しく細胞の生存率、増殖または遺伝子発現に影響を与えません。 dfTATは、小分子、ペプチド、抗体、生物学的に活性な酵素や転写因子を提供することができます。本稿では、dfTAに関わるプロトコルを記述T合成および細胞送達。原稿は、細胞外に投与されたタンパク質の量を変化させることによって、細胞の細胞質ゾル空間に送達されるタンパク質の量を制御する方法について説明します。最後に、この新しい技術と配信の検証に必要な手順の現在の限界が議論されています。記載されているプロトコルは、細胞ベースのアッセイのためだけでなく、 細胞のex vivoで操作し、再プログラミングのために非常に有用です。
Introduction
生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不透過性小分子の送達は、多くの生物学的またはバイオテクノロジー用途（細胞イメージング、機能的アッセイ、細胞の再プログラミングなど ）1-4でしばしば望ましいです。多くの送達アプローチは、既にマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはキャリア剤の使用を含め、報告されている（ 例えば 、例えば、TATのような細胞透過性ペプチド、脂質）5-7。各技術は、典型的には、特定のアプリケーションのためではなく、他人のために、これらのアプローチが適切になるかもしれない特定の長所と短所を持っています。一般的な問題は、 例えば （全人口の貧しい配信の効率化および/ または8,9を配信されるどのくらいの材料の制御の欠如、毒性または有害な生理学的影響10,11、時間的制御の欠如、少数の細胞での配信ではなく、を含みます。、マイクロインジェクション）12、および複雑な化学的結合または製剤スキーム11。
<p clas s = "jove_contentは">最近、我々はこれらの制限を回避する新たな配信戦略を開発しました。この戦略は、dfTAT（二量体蛍光TAT）13という名前のペプチドに依存しています。 dfTATは周知の細胞透過性ペプチド（CPP）TATに由来します。 dfTATは、フルオロフォアのテトラメチルローダミンで標識TATの2つのジスルフィド結合したコピーが含まれています。その類似性にもかかわらず、TATおよびdfTAT活動に大きく異なります。 TATは、典型的には、エンドサイトーシスによって細胞内に内在化されます。このCPPは、しかし、大部分（蛍光顕微鏡で検査したとき、これは通常、細胞内ペプチドの点状の分布につながる）、エンドソーム内に閉じ込められたままになります。 TATのように、dfTATを効率的に細胞によってエンドサイトーシスされます。しかし、dfTATはエンドソーム内に閉じ込められたままにしません。その代わりに、それは非常に効率的な方法でエンドソーム漏れを媒介します。 dfTATのエンドソーム溶解活性は、単純なインキュベーションアッセイにより高分子を提供するために活用することができます。 ntentは ">次のように配信プロセスの現在の理解がある。dfTATがマクロピノサイトーシスを誘導する。その結果、dfTATとともにインキュベートした細胞は、流体相によってメディアに存在する可溶性タンパク質、ペプチド、または小分子（目的の分子、MOI）を取り上げますエンドサイトーシス（ 図1参照）。dfTATとMOIの間の相互作用が必要でない両方のエンティティトラフィック限り一緒にエンドサイトーシス経路内。dfTATはエンドサイトーシスの細胞小器官の内腔内の特定のしきい値に達すると、それはそのエンドソーム漏洩活性を発現する（分子の詳細。）完全には特性決定されて漏出性細胞小器官の内腔の内容のままであり、したがってMOIは、その後、細胞内に放出される。MOIとの接合または製剤スキームが必要とされないように、このアプローチは、したがって、非常に便利です。また、dfTATであるため、直接MOIを変更していない細胞内送達が達成されると、それはまたのMOIの機能を妨害してはならない。また、濃度をdfTATは、配信がメディアでMOIのそれとは独立して使用します。例えば、dfTAT濃度がエンドソーム漏れで再現可能な効率を保証するために、異なる実験間で一定に保つことができます。対照的に、培地中のMOIの濃度が徐々にMOIの所望のレベルを達成するために変更することができる細胞質ゾルに送達しました。dfTATで達成高エンドソーム漏れ効率は、現在までに試験した細胞の多くと非常に無害です。エンドサイトーシス小器官は細胞の重要な構成要素であり、1つはdfTATによって媒介劇的な漏れが有害な細胞応答を伴うことであろうと予想されるので、これは驚きです。しかし、処理された細胞は、未処理の細胞と同じ速度で増殖し、そのトランスクリプトームの有意な変化は表示されません。また、配達は、細胞が失わずに許容されたり、配信プロセスから回復するかことを示し、再現性の配信効率で数分以内に繰り返すことができますエンドサイトーシスまたはエンドソーム漏れ能力。微妙な細胞応答はdfTAT配信およびこれらの応答が探求されないままであるかもしれないものの分子の詳細の間に行わ可能性があります。しかし、高効率、プロトコルの利便性、および毒性の欠如を組み合わせることで、この配信アプローチは、多くの細胞ベースのアプリケーションですぐに有用であることを証明する必要があります。本明細書に提示プロトコルは研究団体にこの技術がアクセス可能にすることを目的としています。
Protocol
Representative Results
Discussion
これは送達効率に影響を与える可能性があるためdfTAT配信に使用される細胞は、（> 90％の集密度）過度にコンフルエントであってはなりません。細胞はまた、健康でなければなりません：文化の中で死んだ細胞がdfTATは（劣化した核から例えば、DNA）を対話することができるアポトーシス断片を放出することができます。これにより、配信効率及びイメージングの質を妨害すること?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).
Materials
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
References
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