Endosomolytic 시약 dfTAT와 배양 라이브 세포에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 분자의 배달
Summary
We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.
Abstract
고분자 배달 전략은 일반적으로 세포 항목의 경로로 세포 내 이입 경로를 사용합니다. 하지만, 엔도 좀 포획 심각 세포 세포질 공간에 침투 고분자의 효율성을 제한한다. 최근에는 시약 dfTAT, 형광 물질로 표지 된 테트라 메틸 TAT 펩타이드의 이황화 결합의 이량 체를 식별하여이 문제를 회피하고있다. 우리는 생균을 관통하고, 특히 고효율로 세포의 세포질 공간에 도달 원형 세포 투과 펩티드 (CPP) TAT, dfTAT의 형광 표지 된 이량 체를 생성 하였다. dfTAT의 시토 졸 전달은 일차 세포를 포함한 여러 세포주에서 얻어진다. 또한, 배달 띄게 세포 생존, 증식 또는 유전자 발현에 영향을주지 않는다. dfTAT는 소분자, 펩티드, 항체, 효소 및 생물학적 활성 전사 인자를 전달할 수있다. 이 보고서에서 우리는 DFTA에 포함 된 프로토콜을 설명T 합성 및 세포 배달. 원고는 세포 외로 투여 된 단백질의 양을 변화시켜 세포의 세포질 공간으로 전달 단백질의 양을 제어하는 방법을 설명합니다. 마지막으로,이 새로운 기술 및 배달 검증에 관련된 단계의 현재 제한이 논의된다. 설명 된 프로토콜은 세포 기반 분석법뿐만 아니라 세포의 생체 외 조작 및 리 프로그래밍에 매우 유용 할 것이다.
Introduction
생균에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 분자의 전달은 많은 생물 또는 생물 공학적 응용 (셀룰러 이미징 기능 분석, 세포 리 프로그래밍, 등.) 1-4에 종종 바람직하다. 다수의 전달 방법은 이미 미세 주입, 전기 천공, 또는 운반 제의 사용을 포함하여,보고되고있다 (예., 예컨대 TAT 같은 세포 투과 펩티드, 지질) 5-7. 각 기술은 일반적으로 특정 응용 프로그램에 대한 아니라 다른 사람에 대한 이러한 접근 방식이 적절 할 수있는 특정 장단점이 있습니다. 일반적인 문제는 소수의 세포가 아니라 전체 인구 및 / 또는 부족 8,9 전달 얼마나 많은 물질의 제어, 독성 또는 해로운 생리 학적 영향 10, 11, 시간 제어의 부족, 배달의 가난한 전달 효율을 (포함 예 :., 마이크로 인젝션) (12) 및 복소 공액 또는 화학적 제제 스킴 11.
<p clas s = "jove_content은"> 최근에, 우리는 이러한 한계를 우회하는 새로운 배달 전략을 개발했다. 이 전략은 dfTAT라는 펩타이드 (이량 체 형광 TAT) (13)에 의존한다. dfTAT는 잘 알고 세포 침투 펩타이드 (CPP) TAT에서 파생됩니다. dfTAT는 형광의 테트라 메틸 표지 TAT의 두 이황화 결합 사본이 포함되어 있습니다. 그들의 유사성에도 불구하고, TAT와 dfTAT 활동에 유의 한 차이. TAT는 일반적으로 엔도 시토 시스에 의해 세포로 내재화된다. 이 CPP 그러나 대부분 (형광 현미경으로 관찰 할 때 일반적으로 세포 내부의 펩타이드의 반점이 분포지도) 엔도 좀 안에 갇혀 상태를 유지합니다. TAT처럼 dfTAT 효율적으로 세포에 의해 endocytosed된다. 그러나 dfTAT는 엔도 좀 안에 갇혀 유지하지 않습니다. 대신에, 그것은 매우 효율적 방식으로 엔도 좀 누설을 매개한다. dfTAT의 endosomolytic 활동은 단순한 배양 분석에 의해 고분자를 제공하기 위해 이용 될 수있다. 다음 ntent "> 전달 프로세스의 현재의 이해이다. dfTAT가 macropinocytosis를 유도한다. 따라서, dfTAT 배양 세포는 액체 상으로 배지에서 본 가용성 단백질, 펩타이드, 또는 작은 분자 (관심 분자 MOI) 차지 엔도 시토 시스는 (도 1 참조). dfTAT 및 MOI 사이의 상호 작용이 함께 세포 내 이입 경로 내의 두 엔티티 트래픽 것이면 불필요하다. dfTAT가 이입 소기관의 루멘 내에서 특정 임계 값에 도달 할 때, 그것은 그것의 엔도 좀 누설 활동 (분자량 상세 표현 dfTAT이기 때문에,이 방식 또한. 따라서 MOI와의 접합이나 배합 방식이 필요하지 않다로 매우 편리하다.). 완전히 특성화 될 누설 소기관의 루멘의 내용을 유지하며, 따라서 MOI 후 세포 내로 방출 세포 내 전달이 달성되면 직접 수정하지 MOI, 또한 MOIs 기능을 방해해서는 안된다. 또한, 농도를dfTAT 배달 미디어에서 MOI의 독립적 인 사용. 예를 들어, dfTAT 농도는 엔도 좀 누설 재현성 효율을 보장하기 위해 여러 실험과 일정하게 유지할 수있다. 대조적으로, 미디어 MOI의 농도는 점차 MOI가 시토 졸 전달의 원하는 레벨을 달성하기 위해 변경 될 수있다.dfTAT 달성 높은 엔도 좀 누설 효율은 현재까지 테스트 한 세포의 많은 현저하게 무해하다. 세포 내 이입 세포 소기관이 세포의 중요한 구성 요소이며, 하나 dfTAT에 의해 매개 극적인 누설이 해로운 세포 반응을 동반 할 것이라고 기대하기 때문 놀라운 일이다. 그러나, 처리 된 세포는 비 처리 세포와 동일한 속도로 증식 및 그들의 사체에 상당한 변화를 표시하지 않는다. 또한, 배달 세포 손실없이 전달 프로세스에서 용납 또는 복구 할 수 있음을 나타내는 하나 재현성 전달 효율을 가진 분 내에서 반복 될 수있다엔도 시토 시스 또는 엔도 좀 누설에 대한 자신의 능력. 미묘한 세포 반응은 dfTAT 제공 및 이러한 응답이 탐험 남아있을 수 있습니다 무엇의 분자 세부 동안 자리를 차지할 수 있습니다. 그러나, 높은 효율, 프로토콜의 편의 및 독성 부족을 결합하여, 이러한 전송 방식은 다수의 세포 – 기반 애플리케이션에 즉시 유용한다. 여기에 제시된 프로토콜은 연구 커뮤니티에이 기술이 액세스 할 수 있도록 목표로하고 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
사람이 지나치게 합류 안된다 dfTAT 전달을 위해 사용되는 세포 (> 90 % 컨 플루 언시)을 전달 효율에 영향을 미칠 수도있다. 세포는 건강해야한다 : 문화의 죽은 세포는 dfTAT이 (저하 핵에서 예를 들어, DNA)을 상호 작용할 수있는 세포 사멸 조각을 해제 할 수 있습니다. 차례로이 전달 효율과 영상의 품질을 방해 할 수 있습니다. 세포 dfTAT를 추가하기 전에 FBS를 제거하기 위해 철저하게 세척해…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).
Materials
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
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