Etikett-free enkelt molekyl Detection Bruke Microtoroid Optiske resonatorer

Abstract

Påvise små konsentrasjoner av molekyler ned til grensen enkelt molekyl har innvirkning på områder som for eksempel tidlig påvisning av sykdommen, og grunnleggende studier av oppførselen til molekylene. Enkelt molekyl deteksjonsteknikker vanligvis benytter etiketter som fluorescerende koder eller kvanteprikker, men etikettene er ikke alltid tilgjengelig, øke kostnader og kompleksitet, og kan forurolige hendelsene som studeres. Optiske resonatorer har dukket opp som et lovende middel for å detektere enkle molekyler uten bruk av etiketter. I dag den minste partikkel oppdaget av en ikke-plasmonically forbedret bart optisk resonator system i løsningen er en 25 nm polystyren sfære ^1. Vi har utviklet en teknikk kjent som Frequency Låsing Optical Whispering Evanescent Resonator (blomst) som kan overgå denne grensen og oppnå label-free enkelt deteksjon molekyl i vandig løsning ^2. Som signalstyrke skalerer med partikkel volum, representerer vårt arbeid a> improveme 100xnt i signal-til-støy-forhold (SNR) over den nåværende teknikkens stand. Her prosedyrene bak FLOWER er presentert i et forsøk på å øke sin bruk i felten.

Introduction

Enkelt molekyl eksperimenter deteksjons er nyttige for å redusere mengden av analytt som brukes i biosensorer, for tidlig påvisning av sykdommer, og for å undersøke de grunnleggende egenskaper av molekyler ^3. Slike eksperimenter blir typisk utført ved anvendelse av etiketter, men etikettene er ikke alltid mulig å oppnå for et bestemt protein, øker kostnadene, kan forstyrre hendelsene som blir studert, og kan være upraktisk, særlig for sanntid på stedet eksperimenter eller point-of- vesenet diagnostikk.

Den nåværende gullstandard for etikett-fri biosensing er overflate-plasmonresonans ^4, men den kommersielle overflate-plasmonresonans-systemer har vanligvis en typisk nedre deteksjonsgrense på rekkefølgen av nM. Nylig har optiske resonatorer dukket opp som en lovende teknologi for label-free enkelt molekyl biodetection ^5. Optisk resonatorer arbeid basert på de langsiktige (ns) sperring av lys ^6,7. Lys er evanescentlykoplet inn i disse enhetene vanligvis via en optisk fiber. Når bølgelengden til lys som går gjennom fiberen stemmer overens med resonansbølgelengden av resonatoren, lys effektivt par til resonatoren. Dette kombinert lyset reflekteres totalt internt i resonatoren hulrom generering av et flyktig felt i nærheten av omkretsen av resonatoren. Som partikler gå inn i det flyktige feltet, og binder seg til resonatoren, resonansbølgelengden av resonator endringene i forhold til volumet av partikkel ^8.

I form av gjenkjenningsmuligheter, har mikro resonatorer tidligere blitt brukt til å detektere enkelt influensa A-virus partikler (100 nm) ^9,10. Nylig har plasmonically forbedret mikro optiske resonatorer blitt anvendt for å påvise enkelt bovint serumalbumin molekyler ^{11 og} 8-mer oligonukleotider ^12, men denne fremgangsmåten begrenser partikkelfangstområdet til 0,3 mikrometer ^{2 per} device. Større fangst området biosensorer er ideelle for å maksimere sjansen for partikkeldeteksjon. Kortsiktig løsning-baserte label-free biosensing teknologier med store (> 100 mikrometer ²⁾ fangst områder har vært begrenset til å påvise polystyrenpartikler ≥ 25 nm.

Vi har utviklet en etikett fritt biosensing system basert på optisk resonator teknologi kjent som Frequency Låsing Optical Whispering Evanescent Resonator (blomst) ^{13 (figur} 1) som er i stand til tids løst påvisning av enkle molekyler i løsningen. FLOWER bruker lang foton levetid microtoroid optiske resonatorer kombinert med frekvens låsing tilbakemeldinger kontroll, balansert deteksjon, og beregnings filtrering for å oppdage små partikler ned til enkeltproteinmolekyler. Bruken av frekvenslåse kan systemet alltid spore forskyvning resonans av microtoroid som binder partiklene, uten behov for å feie eller skanne laserens bølgelengde løpetstore områder. Prinsippene for FLOWER kan brukes til å forbedre gjenkjenning evner av andre teknikker, inkludert plasmonic ekstrautstyr. I det følgende er prosedyrene for å utføre FLOWER beskrevet.

Protocol

1. Forsøksoppsett og Prøvepreparering

1. Fremstill microtoroids ved hjelp av litografi, etsing, og som smelter prosedyre som beskrevet tidligere er ^seks. Fremstill microtoroids på toppen av en silisiumskive (chip) som vanligvis har en større diameter på 80-100 pm, og en mindre diameter på 2 um.
2. Slapp omtrent en meter av single-modus fiber (125 mikrometer kledning, 4,3 mikrometer modus feltet diameter) fra sin fiber spolen.
3. I midten av den avviklede del av den optiske fiber, kle et lite segment (2,5 cm) av polymerbelegget rundt den optiske fiberen ved hjelp av wire strippere. Merk: Dette er den del av den optiske fiber som skal brukes til å evanescently par lys inn i microtoroid.
4. Rengjør strippet fiber med isopropanol alkohol og en lofri tørke.
5. Hold denne delen av fiberen på plass ved hjelp av en fiberholder laget av magnetiske klemmer.
6. Thin strippet fiber til ~ 500 nm ved melting og trekke ved hjelp av en hydrogen lommelykt og to stepper motorer som beveger seg i motsatt retning ved 60 mikrometer / min. Plasser den optiske fiber inne i den øvre del av flammen, som bør være ~ 10 mm høy. Slutte å trekke fiberen når sendingen gjennom fiberen stopper varierende, som kan overvåkes enten visuelt (ved å se lyset som spres sideveis fra fiberen blinke på og av), eller ved å koble fiberen til en fotodiode som er festet til et oscilloskop .
7. Kløyve den ene enden av den optiske fiber og sette det inn i en naken fiber adapter. Plasser denne enden av fiberen inn i inngangen på den fotomottaker.
8. Fiber par den andre enden av fiberen spolen til laseren ved hjelp av en fiberoptisk kopler.
9. Plasser microtoroid chip på toppen av en prøveholder (rustfritt stål, 37,8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) ved anvendelse av enten epoksy eller dobbeltsidig tape.
10. Monter prøveholderen på toppen av en posisjonering scenen som består av en 3-akse nano-posisjonering (nanocube) scene (se utstyrsliste) på toppen av et tre-akse mikrometer. Utføre alle eksperimenter på en pneumatisk isolert optisk bordet for å redusere vibrasjoner.
11. Grov posisjon prøven chip med 3-akse mikrometer.
12. Juster microtoroid holdige chip parallelt med den optiske fiber ved hjelp av nano-positioner. Merk: Juster microtoroid innenfor en avstand på én bølgelengde av inngangs lys (~ 633 nm). For visualisering av denne prosessen bruker to avbildnings kolonner (tube med objektiv og kamera, se utstyrsliste) som er plassert på toppen og på siden av brikken.
13. Optimal polarisasjonen av laserlys rettet gjennom den optiske fiber ved hjelp av en in-line polarisasjonsstyreren (se utstyrsliste) med en knapp for å justere polarisasjonen. Merk: Optimal polarisasjon oppnås når den målte dip i overføring av den optiske fiber vises den smaleste. Observere dette dip på et oscilloskop (se trinn 2.2 for mer informasjon).
14. Konstrueret prøvekammer ved å epoxying et glass dekkglass over prøven trinnet ved hjelp av et mikroskop-objektglass som et avstandsstykke. Merk: En plexiglass kabinett som dekker hele oppsettet kan være nyttig for å minimere luftstrømmer. En liten åpning bør være igjen for å tillate at oppløsningen kan pumpes inn ved hjelp av rør.
15. Termisk likevekt partikkelsuspensjoner eller enkelt-molekyl vandige løsninger for ≥ 1 time i en RT vannbad (~ 500 ml). Merk: Prøver ble fortynnet til den ønskede konsentrasjon i mikrosentrifugerør ved hjelp av de tilhørende buffere som er angitt av produsenten, f.eks, PBS eller HEPES. Hvis ingen bindende hendelser oppdages, øke saltkonsentrasjonen av bufferen.
16. Vortex partikkelholdige løsninger (1 ml) kort for ~ 2 sek.
17. Injiser partikkelholdige løsninger inn i prøvekammeret ved 1 ml / min ved anvendelse av en 1 ml sprøyte pumpe.
18. Etter prøvekammeret har fylt, skru av sprøytepumpe.
19. Vent 30 sekunder før registrering av data for å minimerevirkningene av mekaniske vibrasjoner som følge av fluidstrømning som kan påvirke målingen.

2. Frekvens Locking

1. Re-par toroiden til den optiske fiberen ved å bevege prøveholderen med nanopositioner, fordi koplingen blir forstyrret på grunn av injeksjon av fluid.
2. Finn resonans bølgelengden til microtoroid ved å skanne datamaskinen styrte inngangs laser gjennom en rekke bølgelengder. Dette utføres ved å sende en triangulær bølgeform spenningssignal til et piezoelektrisk element inne i laserstyre som regulerer bølgelengden til laseren. Utføre eksperimenter ved hjelp av synlig lys (635 nm ± 2,5 nm) som det er lav absorpsjon av lys i vann ved denne bølgelengden.
3. Måling av lystransmisjonen gjennom den optiske fiberen ved å koble utgangen fra den optiske fiberen inn i en automatisk balansert fotomottaker. Plugg produksjonen av fotomottaker i et oscilloskop med en BNC kabel. Observere on oscilloskop som ved resonansbølgelengden til microtoroid, synker overføring via den optiske fiber.
4. Fest utgangen fra fotomottaker til hovedinngangen til frekvenslåsetilbakekoblingskontroller (se utstyrsliste) via en kabel.
5. Kjør frekvens låsing tilbakemeldinger kontrolleren i systemlås modus ved hjelp av top-of-peak låsing med en vibrasjonsfrekvens på 2 kHz og en amplitude på bølgelengde svinging av 19 fm. Empirisk angi proporsjonal-integral-derivative innstillinger i programvaren vinduet ved hjelp av Ziegler-Nichols tuning regler ^14. Merk: Disse verdiene trenger bare angis en gang ved begynnelsen av alle forsøk.
6. Automatisk lås bølgelengden til laseren til resonansbølgelengden til microtoroid. Utfør dette trinnet etter fylling prøvekammeret. Merk: Hvis bølgelengden skiftet er for stor, så tilbakemeldingene kontrolleren vil miste lås og automatisk bytte til skannemodus for å finne resonans bølgelengde plassering. Dette occurs for bølgelengde skifter større enn ca en linjebredde (minst 600 fm for alle systemer som er undersøkt her).
7. Registrere utgangssignalet fra tilbakekoblingskontroller på 20 kHz ved hjelp av en 24-bit innsamling kort. Eksportere data som en tekstfil via datainnsamling programvare.

3. Data Processing og analyse

1. Fourier-transformerte data i MATLAB.
2. Lav passerer data ved hjelp av en "murstein-vegg" filter med en cutoff ved 1 kHz for å fjerne pålagt rystelses frekvens på 2 kHz (se Opplysning Kode fil Skjermbilde 1).
3. Beregnings hakk filtrere data ved hjelp av en vindustørrelse på 16 Hz. Merk: Dette gjøres for å fjerne kjente støykilder, i dette tilfellet, 60 Hz elektronisk linjestøy og dens harmoniske, samt 100 Hz (som kommer fra laserdriveren) og dens harmoniske (se Opplysning kodefil Skjermbilde 1).
4. Invers Fourier transformere dataene tilbake til tidsdomenet.
5. Median filter data ved hjelp av et vindustørrelse på 1001 prøver (se Opplysning Kode fil Skjermbilde 2).
6. Lokal trinn endringer i resonansbølgelengden ved hjelp av trinn-algoritme for å finne Kerssemakers et al., ^15.
7. Generer histogrammer av amplituden av hvert bindingstrinn.
8. Beregne partikkelstørrelse bruker Eq. (1) (se diskusjon).

Representative Results

Partikkel bindende hendelser er helt klart sett på som step-lignende endringer i resonans bølgelengde av microtoroid over tid (Figur 2A). Høyder av disse trinnene er vist som et histogram i figur 2B. Figurene 2-4 viser representative spor fra binding av exosomes (nanovesicles), 5 nm silika perler, og single mennesker interleukin-2 molekyler, henholdsvis. Det faktum at de trinnlignende arrangement skaleres med partikkelstørrelse viser at teknikken har blitt korrekt utført. Dette kan bli analysert ved å generere et histogram av trinnhøyder (figur 2B), og å sammenlikne den maksimale trinnhøyden observert teoretiske forutsigelser, som diskutert nedenfor.

Figur 1. Blokkdiagram av toroid følesystem. Lyset fra en avstembar diodelaser er delt w ed en del sendes gjennom den optiske fiber som kopler lys inn i toroiden, og den andre del sendes direkte til en inngang på en auto-balansert fotomottaker. Utgangen fra den optiske fiberen blir sendt inn i den andre inngangen av den automatisk balansert fotomottaker. Utgangen fra fotomottaker blir sendt til tilbakekoblingskontroller som modulerer laserlyset til å finne verdien av resonansbølgelengden til microtoroid. Som partikler bindes til toroiden, er resonansfrekvensforskyvninger. Forskjellen mellom bølgelengde på laseren og resonans bølgelengden til microtoroid sendes til en proporsjonal-integral-derivat kontroller som gjør at laseren for å matche den bølgelengden til toroide så raskt og smidig som mulig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

p_upload / 53180 / 53180fig2.jpg "/>
Figur 2. resonansbølgelengden endres over tid som 20 nm kuler binder seg til overflaten av det microtoroid. (A) Shift i resonansbølgelengden til microtoroid over tid som 20 nm kuler binder seg til overflaten. (B) Histogram av høydene (amplituder) av hver resonans bølgelengde trinn hendelsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. resonansbølgelengden endres over tid som individuelle exosomes binde seg til overflaten av microtoroid. Er individuelle bindende hendelser betraktes som diskrete endringer (trinn) i resonansbølgelengden over tid."> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. resonansbølgelengden endres over tid som 5 nm silika kuler binder seg til overflaten av det microtoroid. Partikler holder seg til toroiden overflaten via passiv adsorpsjon. Partikkelbindingshendelser blir sett på som diskrete trinn i resonansbølgelengden til toroiden over tid. Desorpsjon av en partikkel blir sett på som en nedadgående trinn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. resonansbølgelengden endres over tid som IL-2-molekyler bindes til overflaten av microtoroid. Macromolecular bindingsbegivenheterses som diskrete trinn i resonansbølgelengden over tid. Disse trinnene ligne de i figur 4 som de to typer partikler er av omtrent samme størrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Som en partikkel binder, resonansbølgelengden (λ) av toroidelementene øker. Hvis en partikkel unbinds, resonans bølgelengde tilsvarende reduseres (en step-down hendelse). Den partikkeldiameter (d) kan bestemmes gjennom histogrammer av amplituden for hver bølgelengde trinn. Høyden på hver bølgelengde trinn varierer på grunn av størrelsesvariasjoner fra den bundne partikkel og på grunn av plasseringen på microtoroid hvor partikkelen binder. Den maksimale forandring i resonansbølgelengden (trinn høyde) oppstår når partiklene bindes ved ekvator av microtoroid hvor det elektriske feltet (E _{0, max)} er et maksimum. Denne høyeste trinnet høyde (Δλ) er relatert til partikkeldiameter gjennom Eq. (1) ^8, der a er partikkelradius, er D en dielektrisk konstant på grunnlag av brytningsindeksen for den bundne partikkel og dens omgivende media, er V _m volumet av ligh modust i microtoroid bestemmes ved element simuleringer ^2, og E ₀ (r _r) er amplituden til det elektriske felt ved partikkel ekvator også bestemmes ved element simuleringer:

Invertere Eq. (1) viser at signalstyrken (Δλ) skalerer med partikkel volum ^(3). Vår dielektrisk faktor er definert som:

der er brytningsindeksen til det omgivende media, og er indeksen brytning av partikkelen. Teoretiske estimater for partikkelstørrelse basert på likning (1) samt ytterligere histogrammer og størrelse calninger er presentert i ^{to, 16.}

FLOWER kan modifiseres for raskere sporing ved å øke frekvensen som frekvensen låsetilbakekoblingskontroller spor bølgelengde microtoroid. Databehandlings fremgangsmåte kan modifiseres ved hjelp av et glidende gjennomsnitt istedenfor et medianfilter, og binde hendelsene kan fortsatt gjenopprettes, men medianfilteret bevirker trinn kanter til å være bedre bevart. Begrensninger i denne teknikk inkluderer det faktum at bølgelengden forskyvning av microtoroid ved partikkel-binding er avhengig av hvor på resonatoren partikkel lander. Således bekreftelse av bindingen av en enkelt partikkel er avhengig av dannelsen av et histogram av mange diskrete bindingsbegivenheter. Hvis ingen distinkte bindings hendelser blir detektert, økning av saltkonsentrasjonen av løsningsmidlet hjelper.

Betydningen av denne teknikken med hensyn til eksisterende metoder er at ingen etiketter er nødvendig for å avhøre målmolekylet.Selektiv binding krever imidlertid funksjonalise sensoren med antistoffer. Andre fordeler er det faktum at siden microtoroid resonatorer har større fangst områder sammenlignet med høy følsomhet overflaten plasmonresonans metoder, partikkel bindende hendelser er mer sannsynlig å skje. I tillegg, fordi FLOWER ikke krever fluorescerende koder som kan photobleach, er FLOWER stand til lange (> 10 sek) målinger med rask (millisekund) tidsoppløsning.

Kritiske trinnene i protokollen omfatter samkjøre den optiske fiber taper med microtoroid. Når toroiden er nedsenket i væsken, for mye bevegelse av fiberen gjennom væske kan forårsake at konusen til å bryte, og dermed avslutte forsøket. FLOWER i sin nåværende formulering er derfor uegnet for eksperimenter på tidsskalaen timer. I tillegg, når microtoroid har vært nedsenket i væske og partikler binder, kvalitetsfaktoren (Q) irrecoverably faller over en tidsskala på timer og peak locking etter hvert kan bli ustabil. I denne situasjon er nødvendig for en ny enhet. Fordi vi dither vår laserfrekvensen i et svært lite område rundt resonanstoppen, betyr FLOWER ikke samtidig skanne over hele resonansspektrum og derfor ikke måler endringer i kvalitetsfaktoren i sanntid som partikler bindes. Etter kvaliteten faktor før og etter binding av bare noen få partikler, kan vi ikke se betydelig Q faktor degradering. Vi regner med at dette er fordi de opprinnelige uberørte toroidene har relativt lav Q-faktor (lastet Q i vann av ⁵ ~ 1x10 -5x10 ^6).

Vi merker oss at laser-indusert svingninger støy trekkes ut ved hjelp av auto-balansert fotomottaker. Vi minimere variasjoner i den optiske fiber mot toroiden ved å plassere fiberen i direkte kontakt med den microtoroid. I tillegg, hvis PID parametrene ikke er riktig innstilt, vil svingninger vises, dvs. at systemet ikke vil raskt og accuratEly spor bølgelengde skift. Ziegler-Nichols tuning reglene kan brukes til å sette riktig PID innstillinger ^14. Ved å følge prosedyren som er gitt her, bør det være mulig å detektere størrelse og nanopartikler som strekker seg fra flere hundre nanometer ned til noen få nanometer, deriblant enkle biologiske molekyler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tunable diode laser	Newport	TLB-6300
Laser controller	Newport	TLB-6300-LN
Frequency locking feedback controller	Toptica Photonics	Digilock 110
Auto-balanced photoreceiver	Newport	Model 2007
In-line polarization controller	General Photonics	PLC-003-S-90
24-bit data acquisition card	National Instruments	NI-PCI-4461
Recombinant human interleukin-2	Pierce Biotechnology	R201520
20 nm polystyrene beads	Thermo Scientific	3020A
NanoCube XYZ Piezo Stage	Physik Instrumente	P-611.3
Optical table	Newport	VH3660W-OPT
Objective lens for imaging column	Navitar Machine Vision	1-60228
Imaging column (adaptor tube)	Navitar Machine Vision	1-60228
High-Res CCD camera for imaging column	Edmund Industrial Optics	NT39244