Generation av prostatacancer Patient Härstammar xenograft-modeller från cirkulerande tumörceller

Summary

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Abstract

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

Introduction

Patient härledda xenografter blir alltmer populära experimentella modeller som används för cancerforskning. De kan användas för karakterisering av biomarkörer och biologiska vägar, pre-klinisk utvärdering av läkemedlets effektivitet och skapande av avatarer för personligt cancerterapier ^1,2. Tidigare har andra forskargrupper utvecklade PDX modeller antingen genom att implantera eller injicera enstaka tumör cellsuspensioner eller hela tumör explants i nedsatt immunförsvar möss ^1. Dessa PDX modeller kräver kirurgisk samling av färsk solid tumör, malign ascites eller pleurautgjutning från en patient som genomgår ett kirurgiskt ingrepp som är både kostsamt och utsätter patienten för ökad risk för iatrogen sjuklighet.

En betydande ny utveckling inom cancerforskningen har varit att upptäcka, isolering och karakterisering av cirkulerande tumörceller. Dessa tumörceller fly från den primära tumörmassan och börjar cirkuleradär de spelar en avgörande roll i metastas och återfall, den vanligaste orsaken till cancerrelaterad dödlighet ^3. Utvärderingen och karakterisering av CTCs från flera solida tumörtyper har gett klinisk information för diagnos, prognos och övervakning kvarvarande sjukdom ^3. En mängd olika för närvarande använda metoder som förlitar sig på antingen de fysikaliska egenskaper, uttryck av biomarkörer, eller funktionella egenskaper hos CTCs kan användas för att effektivt isolera CTC ^4. Befintliga makroskala CTC isoleringsmetoder inkluderar densitetsgradientcentrifugering, fysisk filtrering med filter porer och separation mot ytmolekyler. Den mest använda CTC isolering metoder är baserade på antikroppsbaserad infångning av CTCs. Både positiva och negativa urval av cellytemarkörer kan användas för att isolera CTCs från perifert blod. Positiv selektion för CTCs i perifera cirkulationen använder vanligen epitelceller markörer (t.ex. EpCAM) som enre uttrycks på CTCs men inte hematopoietiska celler. Nackdelen med denna metod är att CTCs med metastatisk potential ofta har genomgått epitelial-till-mesenkymala övergång (EMT), som nedreglerar epiteliala ytmarkörer ^3. För att isolera CTCs med metastatisk potential, till en negativ selektionsmetodik vilken utnyttjar det hematopoietiska ytmarkör, CD45, utarma den normala cellpopulationen av leukocyter kan användas ^5.

Prostatacancer är den vanligaste diagnosen cancer och en viktig orsak till cancerrelaterade dödsfall hos män ^6. Mekanismerna för tumörprogression och aggressivitet är inte klarlagd och därför genereringen och karakteriseringen av experimentella modeller som rekapitulera den molekylära heterogeniteten hos prostatacancer är av betydande intresse. PDX modeller av prostatacancer har varit tidigare genereras genom inympning av humana prostatacancerceller i immunocomutlovade möss ^7,8. Emellertid genereringen av sådana modeller har hämmats av den låga engraftment hastigheten för prostatacancer i immunförsvagade möss, som i första hand tillskrivs den indolenta sjukdomens art. Nyligen har CTC använts för att generera bröstcancer ^9, lungcancer ¹⁰ och prostatacancer ¹¹ PDX modeller. Dessa proof-of-concept studier infört möjligheten att generera PDX modeller oberoende av behovet av kirurgisk provtagning. I denna artikel kommer vi i detalj beskriva en metod för generering av denna nya experimentmodell.

Protocol

Detta protokoll har genomförts på vår institution med godkännande från den institutionella forskningsetiska ombord och är i överensstämmelse med alla institutionella, nationella och internationella riktlinjer för mänsklig välfärd. 1. Insamling av perifert blod från patienter med avancerad prostatacancer Obs: Välj patienter med metastaserande prostatacancer. Införskaffa en skriftlig patientens medgivande och spela kliniska egenskaper hos patienter, in…

Representative Results

Detta protokoll kommer att leda till generering av PDX modeller från isolerade CD45 negativ prostatacancer CTC. Baserat på den negativa selektionsmetod som används i våra protokoll är det nödvändigt att utesluta döda celler med användning av DAPI-infärgning. Den procentuella andelen CD45-negativa celler detekterades genom flödescytometri är variabel och beror på tumörbelastning hos patienten (Figur 1A). Immunofluorescens färgning av osorterade celler med användning av CD45 och DAPI (för…

Discussion

Detta manuskript beskriver ett förfarande för generering av prostatacancer PDX modeller ur CTC. Användningen av CTCs för genereringen av PDX modeller har flera potentiella viktiga fördelar jämfört med existerande metoder. Först, tillgänglig samling av CTCs från perifert blod möjliggör generering av experimentella modeller från samma patient vid olika sjukdomsstadier. För det andra representerar bloduppsamling en säkrare och billig metod för att isolera tumörceller jämfört med befint…

Materials

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2×2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 gauge needle
1 ml syringe