التفريق بين الخط خلية SH-SY5Y العصبية الإنسان

Summary

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Abstract

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Introduction

القدرة على استخدام نظم نموذج المختبر عزز كثيرا من مجالات علم الأعصاب وعلم الأعصاب. الخلايا في الثقافة بمثابة منصة فعالة لتوصيف وظيفة البروتين والآليات الجزيئية الظواهر المحددة الأساسية، لفهم علم الأمراض من الأمراض والعدوى، وإجراء عمليات تقييم اختبار المخدرات الأولية. في علم الأعصاب، وأنواع رئيسية من نماذج ثقافة الخلية تشمل الثقافات العصبية الأولية المستمدة من الجرذان والفئران، وخطوط الخلايا العصبية مثل خلايا الفئران B35 ^5، العصبية-2A خلايا فأر ^6، وخلايا الفئران PC12 ^7. على الرغم من أن استخدام خطوط الخلايا مثل هذه تقدمت مجال كبير، وهناك عدة عوامل خارجية مرتبطة التعامل مع الخلايا غير والأنسجة البشرية. وتشمل هذه الأنواع المحددة فهم الاختلافات في عمليات التمثيل الغذائي، الظواهر من مظاهر المرض، والتسبب بالمقارنة مع البشر. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أنإعادة اختلافات كبيرة بين الماوس والتعبير الجيني البشري وعامل النسخ الإشارات، وتسليط الضوء على القيود المفروضة على نماذج القوارض وأهمية التفاهم التي تم حفظها الممرات بين القوارض والبشر ^8-11. ويعمل آخرون على استخدام خطوط الخلايا العصبية البشرية بما في ذلك N-تيرا-2 (NT2) خط البشري خلية سرطانة مسخية والخلايا الجذعية المحفزة محرض (iPSCs). هذه خطوط الخلايا توفر نماذج جيدة لفي المختبر النظم البشرية. ومع ذلك، تمايز الخلايا NT2 مع حمض الريتينويك (RA) النتائج في توليد يسكنها خليط من الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، والخلايا الدبقية شعاعي ^12، مما استلزم خطوة تنقية إضافية للحصول على مجموعات نقية من الخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا NT2 يبرهن على وجود النمط النووي متغير بدرجة كبيرة ^13، مع أكثر من 60 الكروموسومات في 72٪ من الخلايا. iPSCs تظهر التباين في التفريق بين خطوط مختلفة من الخلايا وتتفاوت في كفاءة التمايز ^14، وبالتالي من المستحسن أن يكون نموذجا الخلايا العصبية البشرية متسقة وقابلة للتكرار لتكمل هذه البدائل.

SH-SY5Y خلايا تشبه أرومة عصبية هي subclone من الوالدين خط الخلية العصبية SK-N-SH. تم إنشاء خط الخلية الوالدية في عام 1970 من خزعة نخاع العظم الذي يحتوي على خلايا تشبه الخلايا الظهارية ¹⁵ على حد سواء مثل أرومة عصبية و. الخلايا SH-SY5Y لديها النمط النووي مستقرة تتكون من 47 كروموسوم، ويمكن أن تكون متباينة من دولة مثل أرومة عصبية إلى الخلايا العصبية البشرية الناضجة من خلال مجموعة متنوعة من الآليات المختلفة بما في ذلك استخدام RA، استرات phorbol، وneurotrophins محددة مثل المستمدة الدماغ عامل التغذية العصبية (BDNF). وتشير الأدلة السابقة أن استخدام أساليب مختلفة يمكن اختيار لفرعية الخلايا العصبية محددة مثل الأدرينالية، الكوليني، والخلايا العصبية الدوبامين ^16،17. هذا الجانب الأخير يجعل الخلايا SH-SY5Y مفيدة للعديد من التجارب علم الأعصاب.

ontent "> وقد لاحظ العديد من الدراسات اختلافات هامة بين الخلايا SH-SY5Y في ولاياتهم غير متمايزة ومتباينة، وعندما الخلايا SH-SY5Y هي غير متمايزة، فإنها تتكاثر بسرعة، ويبدو أن غير مستقطب، مع عدد قليل جدا من العمليات، قصيرة. وغالبا ما تنمو في كتل والتعبير عن علامات تدل على الخلايا العصبية غير ناضجة ^18،19. وعندما متباينة، وهذه الخلايا تمتد طويلا، تشعبت العمليات، وانخفاض في انتشار، وفي بعض الحالات استقطاب ^2،18. تم الخلايا SH-SY5Y متباينة تماما أثبتت سابقا للتعبير عن مجموعة متنوعة من علامات مختلفة من الخلايا العصبية الناضجة بما في ذلك البروتين المرتبط النمو (GAP-43)، نوى الخلايا العصبية (NeuN)، synaptophysin (SYN)، متشابك بروتين حويصلة الثاني (SV2)، الخلايا العصبية إينولاز معين (NSE) وأنيبيب المرتبطة بروتين (MAP) ^{2،16،17،20،} وتفتقر إلى التعبير عن علامات الدبقية مثل ييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP) ^(4). وفي مزيد من الدعم الذي يميز الخلايا SH-SY5Y represeالإقليم الشمالي يبلغ عدد سكانها العصبية متجانسة، وإزالة عامل التغذية العصبية نتائج في الخلايا الخلوية ^(4). هذا يشير إلى أن بقاء الخلايا SH-SY5Y متباينة تعتمد على العوامل الغذائية، مماثلة إلى أن تنضج الخلايا العصبية.

وقد ازداد استخدام الخلايا SH-SY5Y منذ تأسيس subclone في عام 1978 ^3. وتشمل بعض الأمثلة على استخدامها يحقق مرض باركنسون ¹⁷ ومرض الزهايمر ^21، والتسبب في العدوى الفيروسية بما في ذلك فيروس شلل الأطفال ^22، الفيروس المعوي 71 (EV71) ^23،24 وفيروس الحماق النطاقي (جدري ^الماء) 1، والفيروس المضخم للخلايا الإنسان ^25، وفيروس الهربس البسيط (HSV) ^2،26. من المهم أن نلاحظ أن العديد من الدراسات باستخدام الخلايا SH-SY5Y وقد استخدمت هذه الخلايا في شكلها غير متمايز، وخاصة في مجال neurovirology ^27-36. الاختلاف في النمط الظاهري الملحوظ من غير متمايزة مقابل الخلايا SH-SY5Y متباينة يثير مسألة عرجذر التقدم لوحظ من العدوى ستكون مختلفة في الخلايا العصبية متباينة ناضجة. على سبيل المثال، متباينة الخلايا SH-SY5Y لها كفاءة أعلى من HSV-1 امتصاص مقابل غير متمايزة، تكاثر الخلايا SH-SY5Y، والذي قد يكون نتيجة لعدم وجود مستقبلات سطح التي تربط HSV وتعدل الدخول على غير متمايزة خلايا SH-SY5Y ^2. ولذلك فمن الأهمية بمكان أن عند تصميم تجربة تركز على اختبار الخلايا العصبية في المختبر، ينبغي التمييز بين الخلايا SH-SY5Y من أجل الحصول على أدق النتائج للترجمة وبالمقارنة مع النماذج في الجسم الحي.

تطوير طريقة يمكن الاعتماد عليها لتوليد الثقافات العصبية الإنسان أمر حتمي السماح للباحثين لإجراء تجارب متعدية هذا النموذج بدقة الجهاز العصبي البشري. بروتوكول المقدمة هنا هو الإجراء الذي يحدد أفضل الممارسات المستمدة من الطرق السابقة ^{1-4 لإثراء} لالخلايا العصبية البشرية التي متباينةاستخدام حمض الريتينويك.

Protocol

1. اعتبارات عامة انظر جدول المواد / المعدات للحصول على قائمة من الكواشف اللازمة. تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة صارمة. استخدام الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (hiFBS) لجميع الاستعدادا…

Representative Results

في الوقت الحاضر، هناك العديد من الحالات في مجال علم الأعصاب وneurovirology حيث يتم استخدام الخلايا SH-SY5Y غير متمايزة كنموذج عملي لالخلايا العصبية البشرية 27-36، والأهم من ذلك، خلايا غير متمايزة قد تفتقر الظواهر مثل الأمثل امتصاص الفيروسي 2 التي هي ضرورة التفسير ال…

Discussion

وينص البروتوكول أعلاه طريقة واضحة وقابلة للتكرار لتوليد الخلايا العصبية الثقافات البشرية متجانسة وقابلة للحياة. هذا البروتوكول يستخدم التقنيات والممارسات التي تدمج العديد من الطرق التي نشرت سابقا ^1-4 والأهداف لتحديد أفضل الممارسات من كل. تمايز الخلايا SH-SY5Y يع…

Materials

B-27	Invitrogen	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	–
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	–
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	–
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	–
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	–
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	–
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	–
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	–
Falcon 35mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	–