एसएच SY5Y मानव neuroblastoma सेल लाइन के भेदभाव
Summary
It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.
Abstract
Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.
Introduction
इन विट्रो मॉडल प्रणाली में उपयोग करने की क्षमता बहुत तंत्रिका जीव विज्ञान और न्यूरो के क्षेत्र में इजाफा किया है। संस्कृति में कोशिकाओं में प्रोटीन की कार्यक्षमता और आणविक तंत्र अंतर्निहित विशिष्ट घटना को चिह्नित करने, बीमारी और संक्रमण की विकृति को समझने के लिए, और प्रारंभिक औषधि परीक्षण आकलन करने के लिए एक कुशल मंच प्रदान करते हैं। तंत्रिका जीव विज्ञान में, सेल संस्कृति मॉडल के प्रमुख प्रकार प्राथमिक neuronal ऐसे चूहे B35 कोशिकाओं 5, न्यूरो-2A माउस कोशिकाओं 6, और चूहे PC12 कोशिकाओं 7 के रूप में चूहों और चूहों, और neuroblastoma सेल लाइनों से निकाली गई संस्कृतियों शामिल हैं। इस तरह के सेल लाइनों के उपयोग के क्षेत्र में काफी उन्नत है हालांकि, वहाँ कई confounding गैर मानव कोशिकाओं और ऊतकों को संभालने के साथ जुड़े कारक हैं। जब मनुष्य की तुलना में इन समझ प्रजाति विशेष के चयापचय की प्रक्रिया में मतभेद, रोग अभिव्यक्ति है, और रोगजनन के phenotypes शामिल हैं। यह भी ध्यान दें कि महत्वपूर्ण हैफिर से माउस और मानव जीन अभिव्यक्ति और प्रतिलेखन कारक सिगनल के बीच महत्वपूर्ण अंतर, कृंतक मॉडल की सीमाओं और समझ है जो रास्ते मूषक और मनुष्यों के बीच 8-11 संरक्षित कर रहे हैं के महत्व को उजागर कर रहे हैं। दूसरों एन तेरा -2 (NT2) मानव teratocarcinoma सेल लाइन और inducible स्टेम कोशिकाओं (IPSCs) सहित मानव neuronal सेल लाइनों का उपयोग कार्यरत है। ये सेल लाइनों में इन विट्रो मानव प्रणाली के लिए अच्छा मॉडल उपलब्ध कराते हैं। हालांकि, retinoic एसिड (आरए) न्यूरॉन्स, astrocytes के एक मिश्रित आबादी की पीढ़ी में परिणाम है, और रेडियल glial कोशिकाओं 12, एक अतिरिक्त शुद्धि कदम की जरूरत के साथ NT2 कोशिकाओं के भेदभाव न्यूरॉन्स की शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए। इसके अतिरिक्त, NT2 कोशिकाओं को एक अत्यधिक चर कुपोषण 13, कोशिकाओं के 72% में अधिक से अधिक से अधिक 60 गुणसूत्रों के साथ प्रदर्शित करता है। IPSCs अलग सेल लाइनों के बीच भेदभाव में परिवर्तनशीलता का प्रदर्शन और भेदभाव दक्षता में भिन्नता 14। यह इसलिए इन विकल्पों पूरक करने के लिए एक सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मानव न्यूरोनल सेल मॉडल है वांछनीय है।
एसएच SY5Y neuroblast कोशिकाओं की तरह माता पिता का neuroblastoma सेल लाइन एस एन श के एक subclone हैं। माता पिता का सेल लाइन एक अस्थि मज्जा बायोप्सी दोनों neuroblast की तरह है और उपकला कोशिकाओं की तरह होता है कि 15 से 1970 में तैयार की गई थी। एसएच SY5Y कोशिकाओं को एक स्थिर 47 गुणसूत्रों से मिलकर कुपोषण है, और आरए के उपयोग सहित विभिन्न तंत्र, phorbol एस्टर, और इस तरह के मस्तिष्क व्युत्पन्न के रूप में विशिष्ट Neurotrophins की एक किस्म के माध्यम से परिपक्व मानव न्यूरॉन्स में एक neuroblast की तरह राज्य से भेदभाव किया जा सकता neurotrophic कारक (BDNF)। पहले सबूत से पता चलता है कि अलग अलग तरीकों का उपयोग इस तरह के एड्रीनर्जिक, कोलीनर्जिक, और डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स 16,17 के रूप में विशिष्ट न्यूरॉन उपप्रकार के लिए चुन सकते हैं। यह बाद पहलू एसएच SY5Y कोशिकाओं तंत्रिका जीव विज्ञान के प्रयोगों की एक भीड़ के लिए उपयोगी बनाता है।
ontent "> कई अध्ययनों से उनकी undifferentiated और विभेदित राज्यों में एसएच SY5Y कोशिकाओं के बीच महत्वपूर्ण अंतर का उल्लेख किया है। जब एसएच SY5Y कोशिकाओं undifferentiated हैं, वे तेजी से पैदा और गैर-ध्रुवीकृत, बहुत कुछ, लघु प्रक्रियाओं के साथ दिखाई देते हैं। वे अक्सर बढ़ने गुच्छों में और एक्सप्रेस मार्कर अपरिपक्व न्यूरॉन्स 18,19 का संकेत है। जब भेदभाव, इन कोशिकाओं को लंबे, शाखायुक्त प्रक्रियाओं, प्रसार में कमी का विस्तार, और कुछ मामलों में फूट डालना 2,18। पूरी तरह से विभेदित एसएच SY5Y कोशिकाओं पहले एक व्यक्त करने के लिए प्रदर्शन किया गया है विकास से जुड़े प्रोटीन (जीएपी-43), न्यूरोनल नाभिक (NeuN), synaptophysin (SYN), synaptic पुटिका प्रोटीन द्वितीय (SV2), विशिष्ट न्यूरॉन enolase (एनएसई) और microtubule जुड़े प्रोटीन (एमएपी) सहित परिपक्व न्यूरॉन्स के विभिन्न मार्कर की विविधता 2,16,17,20, और जैसे glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) के रूप में 4 glial मार्करों की अभिव्यक्ति की कमी है। आगे का समर्थन है कि भेदभाव एसएच SY5Y कोशिकाओं में represeNT एक सजातीय न्यूरोनल जनसंख्या, BDNF को हटाने के सेलुलर apoptosis 4 में परिणाम है। यह पता चलता है कि भेदभाव एसएच SY5Y कोशिकाओं के अस्तित्व पौष्टिकता संबंधी कारकों, न्यूरॉन्स परिपक्व करने के लिए समान पर निर्भर है।एसएच SY5Y कोशिकाओं के उपयोग के बाद से 1,978 subclone 3 में स्थापित किया गया था बढ़ गया है। उनके उपयोग के कुछ उदाहरण पार्किंसंस रोग 17, अल्जाइमर रोग 21, और 22 पोलियो वायरस, enterovirus 71 (EV71) सहित वायरल संक्रमण के रोगजनन 23,24 की जांच में शामिल , छोटी चेचक दाद वायरस (VZV) 1, मानव cytomegalovirus 25, और दाद सिंप्लेक्स वायरस (एचएसवी) 2,26। ऐसा नहीं है कि कई अध्ययनों से ध्यान दें करने के लिए उपयोग एसएच SY5Y कोशिकाओं उनके undifferentiated रूप में इन कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है, विशेष रूप से neurovirology 27-36 के क्षेत्र में महत्वपूर्ण है। बनाम भेदभाव एसएच SY5Y कोशिकाओं undifferentiated मनाया phenotype में अंतर whe का सवाल उठता हैवहाँ संक्रमण की प्रगति मनाया परिपक्व विभेदित न्यूरॉन्स में अलग होगा। उदाहरण के लिए, भेदभाव एसएच SY5Y कोशिकाओं बनाम undifferentiated, proliferating एसएच SY5Y कोशिकाओं है, जो सतह रिसेप्टर्स कि एचएसवी बाँध और अविभाजित एसएच SY5Y कोशिकाओं 2 पर प्रवेश मिलाना की कमी के कारण हो सकता है एचएसवी -1 तेज की एक उच्च क्षमता है। इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि जब एक प्रयोग के लिए इन विट्रो में न्यूरॉन्स के परीक्षण पर ध्यान केंद्रित डिजाइनिंग, एसएच SY5Y कोशिकाओं क्रम में विवो मॉडल के लिए अनुवाद और तुलना के लिए सबसे सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए भेदभाव किया जाना चाहिए है।
एक विश्वसनीय पद्धति के विकास के मानव neuronal संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए शोधकर्ताओं translational प्रयोगों सही है कि मानव तंत्रिका तंत्र मॉडल प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक प्रक्रिया है कि पिछले विधियों 1-4 से निकाली गई सर्वोत्तम प्रथाओं रूपरेखा बनाती है मानव न्यूरॉन्स कि भेदभाव कर रहे हैं के लिए संतुष्ट करने के लिए हैretinoic एसिड का उपयोग कर।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊपर प्रोटोकॉल एक सीधा और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि समरूप और व्यवहार्य मानव neuronal संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल की तकनीक और तरीकों कि कई पहले प्रकाशित तरीकों 1-4<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful for the contributions of Yolanda Tafuri in optimizing conditions for SH-SY5Y differentiation, and for the support of Dr. Lynn Enquist, in whose lab this work was initiated. Y. Tafuri contributed the images shown in Figure 3. This work was supported by the NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR) Bioinformatics Resource Center (MLS and L. Enquist) and K22 AI095384 (MLS).
Materials
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug) | See Table 1 for preparation |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
| DMSO | ATCC | 4-X | – |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | – |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | – |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | – |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | – |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | – |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | – |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | – |
| Falcon 35mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | – |
References
- Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
- Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
- Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. 암 연구학. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
- Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
- Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
- Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
- Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
- Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
- Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174 (2011).
- Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
- Hu, B. -. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. 암 연구학. 33 (11), 2643-2652 (1973).
- Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
- Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
- Cheung, Y. -. T., Lau, W. K. -. W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
- Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer’s disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
- La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
- Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826 (2012).
- Xu, L. -. J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948 (2013).
- Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
- Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
- Yun, S. -. I., Song, B. -. H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290 (2014).
- Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
- Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
- Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
- Xu, K., Liu, X. -. N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
- Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
- Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
- Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
- Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
- Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862 (2013).
- Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
- Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).
