Дифференциация клеточной линии SH-SY5Y нейробластомы человека

Summary

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Abstract

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Introduction

Возможность использования в пробирке модельных систем значительно расширили поля нейробиологии и неврологии. Клетки в культуре обеспечивают эффективную платформу для характеристики функциональности белка и молекулярные механизмы, лежащие специфические явления, чтобы понять патологию заболевания и инфекции, а также для выполнения предварительных оценок по тестированию на наркотики. В нейробиологии, основные типы моделей клеточных культур включают первичные нейрональные культуры, полученные от крыс и мышей, и клеток нейробластомы линий, таких как крысы B35 клеток ^5, нейро-2A клетками мышиной ⁶ и крысы РС12 клетки ^7. Хотя использование таких клеточных линий значительно продвинулась поле, существует несколько сопутствующих факторов, связанных с обработкой клетки и ткани, отличных от человека. Речь идет о понимании видоспецифические различия в метаболических процессах, фенотипы проявления заболевания и патогенезе, по сравнению с людьми. Важно также отметить, чтоRe значительные различия между мышью и экспрессии генов человека и сигнализации фактора транскрипции, выделяя ограничений моделях грызунов и важности понимания, какие пути обеспечить сохранение грызунов и человека ^8-11. Другие использовали использование нейронных клеточных линий человека, включая N-ТЕРА-2 (NT2) линии человеческого тератокарцинома клеток и индуцируемых плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Эти клеточные линии обеспечивают хорошие модели для в пробирке человеческих систем. Тем не менее, дифференциация NT2 клеток с ретиноевой кислотой (RA) приводит к образованию смешанной популяции нейронов, астроциты и радиальных глиальных клеток ^12, что требует дополнительной стадии очистки для получения чистых популяций нейронов. Кроме того, NT2 клетки демонстрируют высокую переменную кариотип ^13, с более 60 хромосом в 72% клеток. иПСК продемонстрировать вариабельность дифференциации между различными клеточными линиями и различаются по эффективности дифференцировки ^14. Поэтому желательно иметь последовательную и воспроизводимую модель нейрона человека дополнить эти альтернативы.

SH-SY5Y Нейробласт-подобные клетки являются подклон из клеток нейробластомы родительской линии SK-N-SH. Клеточная линия родительская сформировалась в 1970 из биопсии костного мозга, который содержит как Нейробласт, как и эпителиальные клетки, как ^15. SH-SY5Y клетки имеют стабильный кариотип, состоящую из 47 хромосом, и могут быть дифференцированы от нейробластов состояние, подобное в зрелые человека нейронов с помощью разнообразных различных механизмов, включая использование RA, форболовыми эфиров и конкретных нейротрофинов, таких как полученный из головного мозга нейротрофический фактор (BDNF). До данные свидетельствуют о том, что использование различных методов можно выбрать для конкретных нейронных подтипов, таких как адренергических, холинергических и дофаминергических нейронов ^16,17. Этот последний аспект делает SH-SY5Y клетки полезные для множества нейробиологии экспериментов.

ontent "> Несколько исследований отметили важные различия между клетками SH-SY5Y в их недифференцированных и дифференцированных состояний. При SH-SY5Y клетки недифференцированные, они быстро размножаются и кажутся Неполяризованное, с очень немногими, коротких отростков. Они часто растут в комки и экспрессируют маркеры, указывающие незрелых нейронов ^18,19. Когда дифференцированы, эти клетки распространяются длинные разветвленные процессы, уменьшение пролиферации, а в некоторых случаях поляризуют ^2,18. Полностью дифференцированные клетки SH-SY5Y ранее продемонстрировано выразить множество различных маркеров зрелых нейронов в том числе роста-ассоциированный белок (GAP-43), нейронных ядер (Neun), синаптофизином (SYN), синаптических пузырьков белка II (SV2), нейрон энолаза (NSE) и ассоциированный с микротрубочками белка (MAP) ^2,16,17,20 и лишены экспрессии глиальных маркеров, таких как глиального фибриллярного кислого белка ^{(GFAP) 4.} в дальнейшей поддержки, что, дифференцированное SH-SY5Y клетки represeнт однородный нейронов населения, удаление BDNF приводит сотовой апоптоза ^4. Это говорит о том, что выживаемость дифференцированных клеток SH-SY5Y зависит от трофических факторов, подобных зрелые нейроны.

Использование SH-SY5Y клеток увеличилось с подклон была создана в 1978 ^3. Некоторые примеры их использования включают расследование болезни Паркинсона ^17, болезнь Альцгеймера ²¹ и патогенез вирусных инфекций, включая полиовируса ²² энтеровирусной 71 (EV71) ^23,24 , вирус ветряной оспы (VZV) ^1, цитомегаловируса человека ^25, и вирус простого герпеса (ВПГ) ^2,26. Важно отметить, что ряд исследований с использованием SH-SY5Y клетки использовали эти клетки в их недифференцированном виде, особенно в области neurovirology ^27-36. Разница в наблюдаемом фенотипа недифференцированные против дифференцированных клеток SH-SY5Y поднимает вопрос о Wheтермо наблюдаемое прогрессирование инфекции будет отличаться в зрелых дифференцированных нейронов. Например, дифференцированные клетки SH-SY5Y имеют более высокую эффективность HSV-1 поглощение в сравнении недифференцированных пролиферирующих SH-SY5Y клеток, которые могут быть из-за отсутствия поверхностных рецепторов, которые связываются HSV и модулируют запись на недифференцированных клеток SH-SY5Y ^2. Поэтому очень важно, что при проектировании эксперимент, направленные на установление нейронов в пробирке, клетки SH-SY5Y следует дифференцировать с целью получения наиболее точных результатов для перевода и сравнения с моделями в естественных условиях.

Создание надежного способа для генерации культур нейронов человека важно, чтобы исследователи для выполнения поступательные эксперименты, которые точно моделируют нервную систему человека. Протокол, представленные здесь это процедура, которая очерчивает лучшие практики, полученные из предыдущих методов ^1-4 для обогащения человеческих нейронов, которые дифференцируютсяиспользуя ретиноевой кислоты.

Protocol

1. Общие соображения См Таблицу материалы / Оборудование для списка необходимых реагентов. Выполните все шаги под строгим асептических условиях. Используйте инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (hiFBS) для всех препаратов медиа, которые включают FB…

Representative Results

В настоящее время существует много примеров в области нейробиологии и neurovirology где недифференцированные клетки SH-SY5Y которые используются в качестве функциональной модели для человека нейронов 27-36 и, что важно, недифференцированные клетки могут не фенотипов, такие как оптимально?…

Discussion

Выше протокол обеспечивает простой и воспроизводимый метод для создания однородных и жизнеспособных нейронов культур человека. Этот протокол использует методы и практики, которые объединяют несколько ранее опубликованных методов ^1-4 и цели очертить лучшие практики друг. Диффер…

Materials

B-27	Invitrogen	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	–
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	–
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	–
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	–
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	–
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	–
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	–
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	–
Falcon 35mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	–