SH-SY5Y İnsan Nöroblastom Hücre Hattı Farklılaşma

Summary

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Abstract

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Introduction

Vitro model sistemlerinde kullanma yeteneği büyük ölçüde nörobiyoloji ve nörolojik bilimler alanlarını artırmıştır. kültürde Hücreler hastalık ve enfeksiyon patolojisi anlamak ve ön uyuşturucu testi değerlendirmeleri gerçekleştirmek için, protein işlevsellik ve moleküler mekanizmalar yatan spesifik olayları karakterize etmek verimli bir platform sağlar. Nörobiyolojisinde, hücre kültürü modelleri arasında en önemli tipleri, örneğin, sıçan B35 hücreleri ^5, Neuro-2A, fare hücreleri ⁶ ve sıçan PC12 hücrelerinin ^{7 gibi} sıçan ve fareler ve nöroblastom hücre çizgilerinden türetilen primer nöron kültürleri içerir. Bu hücre çizgilerinin kullanımı önemli ölçüde alanı gelişmiş olmasına rağmen, insan olmayan hücreler ve doku tutulması ile ilgili çok sayıda karıştırıcı faktörler vardır. insanlara kıyasla bu anlayış türe özgü metabolik süreçlerde farklılıkları, hastalık tezahürü ve patogenezi fenotipleri içerir. Dikkat etmek de önemlidirkemirgen modellerinin sınırlamaları ve yollar kemirgenler ve insanlarda ^8-11 arasında korunmuştur anlayış önemini vurgulayarak fare ve insan gen ifadesi ve transkripsiyon faktörü sinyalizasyon arasında önemli farklılıklar, yeniden bulunmaktadır. Diğer N-tera-2 (NT2), insan teratokarsinoma hücre hattı ve uyarılabilir pluripotent kök hücreler (iPSCs) dahil olmak üzere insan nöronal hücre çizgilerinin kullanımı kullanmışlardır. Bu hücre hatları in vitro insan sistemler için iyi modeller sunar. Bununla birlikte, retinoik asit (RA) nöronları, astrositler oluşan karışık bir popülasyonda oluşmasına neden ve ek saflaştırma adımı gerektiren radyal glial ^hücreleri 12 ile NT2 hücre farklılaşması nöronların saf popülasyonları elde edildi. Buna ek olarak, NT2 hücre hücrelerin% 72 daha büyük 60 kromozomlu bir çok değişken karyotipe ¹³ göstermektedir. iPSCs farklı hücre hatları arasında farklılaşmasında değişkenlik göstermektedir ve farklılaşma etkinliğinde değişiklik gösterebilir ^14. Alternatiflerin güzelleştirmek için tutarlı ve tekrarlanabilir bir insan nöron hücresi modeli olması arzu edilen bir durumdur.

SH-SY5Y neuroblast benzeri hücreler, ebeveyn nöroblastoma hücre çizgisi SK-N-SH bir alt klon vardır. Parenteral hücre hatları neuroblast benzeri ve epitel benzeri hücreler ¹⁵ hem de içeren bir kemik iliği biyopsisinden 1970 üretilmiştir. SH-SY5Y hücreleri 47 kromozom içeren stabil karyotipe sahiptir ve farklı RA kullanımı dahil olmak üzere, mekanizma, forbol esterler ve beyin-türevi gibi belirli nörotrofinlerin çeşitli aracılığıyla, olgun insanlara özgü nöronlar bir neuroblast benzeri durumundan ayırt edilebilir nörotrofik faktör (BDNF). Önceki kanıtlar, farklı yöntemlerin kullanılması gibi adrenerjik, kolinerjik ve dopaminerjik nöronlar ^16,17 gibi belirli nöron alt tipleri için seçebileceğiniz düşündürmektedir. Bu ikinci yönü Nörobiyoloji deneyler bir çok yararlı SH-SY5Y hücreleri sağlar.

ontent "> Çeşitli çalışmalar onların farklılaşmamış ve farklılaştırılmış devletlerde SH-SY5Y hücreleri arasındaki önemli farklılıklar kaydetti. Zaman SH-SY5Y hücreleri farklılaşmamış, onlar hızla çoğalır ve çok az, kısa süreçleri, polarize olmayan gözükmektedir. Bunlar genellikle büyümek farklılaştırılmış olgunlaşmamış nöronların ^18,19 göstergesidir kümeleri ve ekspres belirteçleri., bu hücrelerin uzun kollara ayrılmış işlemleri, çoğalma azalma uzanır, ve bazı durumlarda ^2,18 polarize. farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri, daha önce bir ifade gösterilmiştir büyüme-ilişkili protein (GAP-43), nöronal çekirdekleri (Neun), sinaptofizin (SYN), sinaptik vezikül proteini II (SV2), nöron spesifik enolaz (NSE) ve mikrotübül ilişkili protein (MAP) dahil olgun nöronlar farklı belirteçlerin çeşitli ^2,16,17,20, ve glial fibriller asidik protein (GFAP) ^{4 olarak} glial markerlerin ifadesi için geçerli değildir. SH-SY5Y hücreleri huk ayırt fazla desteklemeknt homojen bir nöronal nüfus, BDNF kaldırılması hücresel apoptoz ⁴ sonuçlanır. Bu farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin hayatta kalma nöronlar olgun benzer trofik faktöre bağlı olduğunu göstermektedir.

Subclone 1978 ³ yılında kurulmuştur beri SH-SY5Y hücrelerinin kullanımı artmıştır. Kullanımlarına bazı örnekler Parkinson hastalığı ^17, Alzheimer hastalığı ²¹ ve poliovirüsün ²² enterovirüs 71 (EV71) gibi viral enfeksiyon patogenezi ^23,24 soruşturma dahil , varicella-zoster virüsü (VZV), ^1, insan sitomegalovirüs ^25, ve herpes simpleks virüsü (HSV) ^2,26. Özellikle neurovirology ^27-36 alanında, SH-SY5Y hücreleri farklılaşmamış formunda bu hücreleri kullandık kullanarak bu çeşitli çalışmalar dikkat etmek önemlidir. ayırt SH-SY5Y hücrelerinin karşılık farklılaşmamış gözlenen fenotipin fark whe sorusunu gündeme getirmektedirTher enfeksiyon gözlenen ilerleme olgun farklılaştırılmış nöronlar farklı olurdu. Örneğin, farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri, HSV bağlanan ve farklılaşmamış SH-SY5Y hücrelerinin ² giriş modüle yüzeyi reseptörlerinin olmaması olabilir farklılaşmamış, prolifere olan SH-SY5Y hücrelerinin karşı, HSV-1 alımı, daha yüksek bir verimliliğe sahiptir. In vitro nöronları test odaklı bir deney tasarımı, SH-SY5Y hücreleri in vivo modeller için çeviri ve karşılaştırma için en doğru sonuçlar elde etmek için farklılaştırılması gerektiğini bu nedenle önemlidir.

insan nöronal kültürlerin üretmek için güvenilir bir yöntem geliştirme araştırmacılar doğru insan sinir sistemini modellemek öteleme deneyler gerçekleştirmek için izin zorunludur. Burada sunulan protokol farklılaşmış insan nöronlar için zenginleştirmek için önceki yöntemlerden ^1-4 türetilen en iyi uygulamaları delineates bir işlemdirretinoik asit.

Protocol

1. Genel Hususlar Gerekli reaktiflerin listesi için Malzemeleri / Ekipman Tablo bakın. sıkı aseptik koşullarda tüm adımları uygulayın. FBS içeren tüm ortam preparasyonlar için ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (hiFBS) kullanın. Isı ile inaktive edilmesi için, her 10 dakikada bir ters çevrilerek 30 dakika için 56 ° C'de FBS, 50 ml'lik bir şişe sıcak (ayrıca Tablo 1 e bakınız). Not: FBS ısı inaktive ed…

Representative Results

Şu anda, bu tür olan optimum viral alımı 2 olarak farklılaşmamış SH-SY5Y hücreleri önemlisi, farklılaşmamış hücreler olmayabilir insan nöronlar 27-36 ve fenotipleri için fonksiyonel bir model olarak kullanılmakta olan nörobiyoloji ve neurovirology alanında birçok örnekleri vardır doğru yorumlanması için gerekli. In vitro nöronal sistem SH-SY5Y hücreleri kullanılarak ya da başka bir zaman, hücreler uygun bir şekilde, in vivo nöron meydana olabilir n…

Discussion

Yukarıdaki protokol homojen ve uygun bir insan nöronal kültürler meydana getirmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu protokol teknikleri ve her birinin en iyi uygulamaları tanımlamak için birkaç daha önce yayınlanmış yöntemler ^1-4 ve amaçlarını entegre uygulamaları kullanır. SH-SY5Y hücrelerinin farklılaşması kademeli serum yoksunluğu dayanır; retinoik asit, nörotrofik faktörler ve hücre dışı matris proteinlerinin eklenmesi; ve seri yarma farklılaşmış olgu…

Materials

B-27	Invitrogen	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	–
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	–
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	–
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	–
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	–
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	–
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	–
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	–
Falcon 35mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	–