사용 소포체 칼슘 항상성 모니터링<em> Gaussia</em> 루시 페라 제 SERCaMP
Summary
Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.
Abstract
소포체 (ER)의 농도가 약 세포질 수준보다 5,000 배와, 세포 내 칼슘의 높은 수준을 포함하고 있습니다. ER 칼슘 통해 엄격한 제어는 단백질 접힘, 수정 및 인신 매매에 대한 필수적입니다. ER 칼슘에 섭동이 펼쳐진 단백질 응답, 3 구 ER 스트레스 반응기구의 활성화를 초래하고, 다양한 질병의 병인에 기여할 수있다. 질병의 발병과 진행하는 동안 응급실 칼슘 변경을 모니터링하는 기능은 실제로는 원칙적으로 중요한, 아직 도전이다. 칼슘 의존 형광 염료와 단백질과 같은 모니터링 응급실 칼슘 현재 가능한 방법은, 그러나 이러한 도구는 생체 내 연구에 적합하지 않은 세포에서 ER 칼슘 역학에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 우리 연구소는 Gaussia 루시 페라 제의 카르복시 말단에 수정에 대한 응답으로 기자의 분비를 부여하는 것을 보여 주었다ER 칼슘 고갈. 시험 관내 및 생체 내 적용에서 루시페라아제 기초 분비 ER 칼슘 모니터링 단백질 (SERCaMP)를 사용하는 방법이 설명된다. 이 동영상은 응급실 칼슘의 종 모니터링 간 주사, GLuc-SERCaMP, 혈액 수집 및 처리의 약리 조작, 분석 매개 변수를 강조한다.
Introduction
소포체 (ER) 1 시그널링 단백질 접힘, 분비 단백질, 지질 항상성, 세포 내 및 세포를 포함한 많은 용량으로 기능한다. 일반 응급실 기능의 핵심은 ~ 5,000 시간에 내강 칼슘 농도 세포질 2-4에서 발견을 유지하고있다. 이 에너지 집약적 인 공정은 사코 / 소포체 칼슘 ATP 아제 (SERCA), ER에 칼슘 이온을 이동시키는 펌프에 의해 조절된다. 응급실에서 칼슘의 유출은 주로 ryanodine (RyR)과 이노시톨 인산염 (IP3R) 수용체에 의해 매개된다. 많은 ER 프로세스 칼슘에 따라 달라 지므로, 저장을 방해하는 것은 ER 스트레스 결국 세포 사멸을 초래할 수있다.
ER 칼슘 조절 장애는, 심근 병증, 당뇨 알츠하이머 질환에서 관찰되었으며, 파킨슨 5. 이들 질환의 점진적 특성으로 인해, 그것은 인과 재 묘사하는 도전되었습니다ER 칼슘 저장소의 병인과 변화 사이 lationship. 기술의 숫자는 염료 및 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)를 포함하여 ER 칼슘 역학, 우리의 이해에 상당한 발전을 허용했다. 칼슘 이온에 결합 될 때 형광 증가 선호도가 낮은 칼슘 염료, 칼슘 6 고농도 세포 내 구획을 조사하는 세포에로드 될 수있다. 이러한 D1ER 포수로 GECIs는, 세포 내 현지화 7-9의보다 정확한 제어와 칼슘 변동 모니터링 할 수 있습니다. 최근 GECIs의 다른 클래스라는 칼슘 측정 소기관 – 포획 단백질 지표 (CEPIA)가 10을 설명 하였다. 유전학과 결합 세 번째 방법 작은 분자의 화학입니다 대상 – 에스 테라 염료 로딩 에스테르 계 칼슘 염료 11 (ER을 대상으로) 유전자 인코딩 된 카르 복실를 활용 (TED)는.
afor 동안ementioned 방법은 형광의 급성 측정을 통해 ER 칼슘 역학에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다, 고유의 강점과 약점을 가지고 있습니다. 그러나 이들은 종종 질병 진행을 조사하는 데 필요한 길이의 연구에 최적이 아니다. 장시간에 걸쳐 칼슘 역학을 모니터링하는 방법을 고안하기위한 목적으로, 우리는 식별되고 분비 ER 칼슘 모니터링 단백질 (SERCaMPs) (12)을 만드는 단백질 변형을 개발 하였다.
SERCaMP 반복해서 ER 칼슘 저장소를 심문하는 최소 침습적 방법을 제공함으로써, 다른 방법론과 관련된 몇 가지 제한을 우회. 우리는 이전에 카복시 말단 펩티드 ASARTDL (알라닌 – 알라닌 – 세린 – 트레오닌 아르기닌 아스파라긴산 류신)는 ER 보존을 촉진하기에 충분한 것으로 증명; 그러나, ER 칼슘의 감소를 일으킬 조건 하에서, 단백질 서열은 더이상의 ER localizatio을 유지할 수 없다n 및 단백질 13 분비된다. SERCaMP 기술의 기초는 분비 된 단백질의 카르복시 말단 분비 따라서 ER 칼슘 조절 곤란 (12)의 견고한 리포터를 생성 ER 칼슘 고갈에 의해 트리거되도록 (예 Gaussia 루시페라아제 또는 GLuc)에 ASARTDL의 부속물이다. 형질 전환 방법을 통해 GLuc-SERCaMP의 발현은 ER 칼슘 항상성의 지표로 GLuc 활성의 변화를 분석 할 수있는 세포 배양 배지 및 혈장을 포함한 생물학적 유체를 가능하게한다. 이 방법은 시험 관내 및 생체 내 ER 칼슘 저장소의 누진 변화의 길이 연구 응용을 갖는다. 다음 프로토콜 ER 칼슘 항상성 공부 GLuc 기반 SERCaMP을 사용한 일반적인 윤곽으로 기록되지만, 프로토콜은 다른 리포터 SERCaMPs 대한 지침을 제공 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 시험관을 하이라이트 GLuc-SERCaMP 생체 유틸리티 ER 칼슘 고갈를 모니터링. SERCaMP를 생성하는 단백질 수정 다른 기자 단백질 (12)에 일반화 보이지만, 우리는 다른 루시페라아제 (18)에 비해 견고한 (200 ~ 배 이상) 생물 발광에 대한 Gaussia 루시 페라 제를 선택했다. 우리는 일차 래트 피질 뉴런, SH-SY5Y 세포 및 쥐의 간으로 전달 GLuc-SERCaMP 바이러스…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.
Materials
| 1.5mL tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1mL luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200uL filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30g needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
References
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