Мониторинг эндоплазматической сети кальциевого гомеостаза Использование защитного<em> Gaussia</em> Люциферазы SERCaMP
Summary
Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.
Abstract
Эндоплазматическая сеть (ЭР) содержит высокий уровень внутриклеточного кальция, с концентрацией примерно 5000 раз больше, чем цитоплазматических уровней. Жесткий контроль над ER кальция необходимо для сворачивания белка, модификации и торговли людьми. Возмущение в ER кальция может привести к активации разложенном ответ белка, тройного механизма в ответ ER стресс и способствуют патогенезу в различных заболеваний. Возможность отслеживать изменения ЭР кальция во время начала заболевания и прогрессирования принципиально важно, но сложно на практике. В настоящее время доступны методы мониторинга ER кальция, такие как кальций-зависимых флуоресцентных красителей и белков, предоставили понимание динамики ЭР кальция в клетках, однако эти инструменты не подходят для исследований в естественных условиях. Наша лаборатория продемонстрировала, что модификация карбокси-конца Gaussia люциферазы дает секрецию репортера в ответ наЭР истощение кальция. Методы с использованием люциферазы основе, секретируемый белок ЭР мониторинг кальция (SERCaMP) для ин витро и ин виво приложений описаны здесь. Это видео подчеркивается печени инъекции, фармакологической манипуляции Gluc-SERCaMP, сбора и обработки крови и параметры анализа для продольной мониторинга ER кальция.
Introduction
Эндоплазматическая сеть (ER), функции во многих клеточных мощностей в том числе сворачивания белка, секреции белка, липидов гомеостаза, и внутриклеточная сигнализация 1. Центральное место в нормальной функции ER является поддержание просвета концентрации кальция на ~ 5000 раз те нашли в цитоплазме 2-4. Этот интенсивный энергетический процесс регулируется АТФ-азы Сарко / эндоплазматическая сеть кальция (SERCA), насос, который перемещает ионы кальция в ER. Истечение кальция из ER опосредовано главным образом Рианодин (RyR) и инозитолтрифосфата (IP3R) рецепторов. Потому что многие процессы ER зависит от кальция, нарушая магазин может привести к ER стресса и возможной смерти клеток.
ЭР нарушение регуляции кальция наблюдается при заболеваниях, включая кардиомиопатия, диабет, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и 5. Благодаря прогрессивной природы этих заболеваний, она была сложной, чтобы очертить причинно-следственную Reвисимостью между патогенеза и изменений в магазине ER кальция. Ряд технологий позволили значительные успехи в нашем понимании динамики ЭР кальция, в том числе красителей и генетически кодируемых показателей кальция (GECIs). Низкое сродство красители кальция, который увеличение флуоресценции при связывании с Ca 2+, могут быть загружены в клетках изучить субклеточных компартментах с высокими концентрациями кальция 6. GECIs, такие как D1ER и ловец позволяют для мониторинга колебаний кальция с более точным контролем субклеточном локализации 7-9. Недавно другой класс GECIs называемые кальциевые измерения органелл захваченных показатели белка (Cepia) были описаны 10. Третий подход, сочетающий генетики и химии малая молекула является мишенью-эстеразы краситель нагрузка (TED), который использует генетически закодированный карбоксилэстеразы (ориентированы на ER) с эфира на основе красителя кальция 11.
В то время как A дляementioned подходы присущи сильные и слабые стороны, они могут предоставить ценную информацию в динамике кальция ER через острых измерений флуоресценции. Они, однако, не является оптимальным для продольных исследований часто, необходимых для расследования прогрессирование заболевания. С целью разработки способа контролировать динамику кальция в течение длительного периода времени, мы определили и разработали модификацию белка для создания белков, секретируемых ER кальция мониторинга (SERCaMPs) 12.
SERCaMP обходит несколько ограничений, связанных с другими методиками, обеспечивая минимально инвазивной подход многократно опросить магазин ЭР кальция. Ранее нами было показано, что карбокси-концевой пептид ASARTDL (аланин-серин-аланин-аргинин-треонин-аспарагиновой кислоты-лейцин) достаточно для содействия сохранению ER; Однако, в условиях, которые вызывают снижение в ЭР кальция, последовательность пептида больше не в состоянии сохранить ER localizatioп и белок секретируется 13. Основой технологии является SERCaMP придатком ASARTDL к карбокси-конца секретируемого белка (например, Gaussia люциферазы, или Gluc), что секреция вызвано истощением ER кальция, тем самым создавая надежную корреспонденту ER нарушения регуляции кальция 12. Выражение Gluc-SERCaMP помощью трансгенных методов позволяет биологических жидкостей, включая среду для культивирования клеток и плазмы анализируемого изменений в Gluc деятельности как индикатор гомеостаза ER кальция. Метод имеет приложения для продольного исследования прогрессивных изменений в ER магазине кальция в пробирке и в естественных условиях. Следующий протокол записывается в виде общих чертах для использования Gluc основе SERCaMP учиться ER гомеостаз кальция, но протокол может служить в качестве руководства для альтернативных репортеров SERCaMPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол подчеркивает в пробирке и в естественных условиях полезности Gluc-SERCaMP контролировать истощение ER кальция. Хотя модификации белков для создания SERCaMP появляется обобщить с другими репортеров белков 12, мы выбрали Gaussia люциферазы для прочной (200-1000 раз большей) ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.
Materials
| 1.5mL tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1mL luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200uL filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30g needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
References
- Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).
- Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).
- Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).
- Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).
- Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).
- Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).
- Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).
- Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
- Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).
- Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).
- Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).
- Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).
- Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).
