Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.
心肌梗死(MI)具有在生理和行为水平显着中期和长期的后果,但所涉及的机制仍不清楚。我们的实验室已开发出心肌梗死后综合征,显示受损心脏的功能,在边缘系统的神经元丧失,认知障碍和抑郁的行为迹象的大鼠模型。在神经元水平,胱天蛋白酶-3的活化介导的MI后凋亡不同边缘区域,如杏仁核 – 3天达到峰值后心肌梗塞。认知和行为障碍出现2-3周后MI和这些与caspase-3的活性的措施相关统计学。这里描述的协议被用来诱发心肌梗死,收集杏仁核组织和使用荧光分光光度法测定caspase-3活性。为了诱导心肌梗死,所述下行冠状动脉被遮挡40分钟。该协议为caspase-3的活性评价心梗开始后第3天:被处死老鼠和杏仁核中分离RAPI从大脑DLY。样品迅速在液氮中冷冻并保持在-80℃直至实际分析。以评估的caspase-3的激活的技术是基于一个衬底(DEVD-AMC)由胱天蛋白酶-3,释放可通过荧光分光光度法来测量一个荧光化合物的裂解。该方法是定量的和可再现的,但所需要的设备是昂贵的,用于量化样品的过程是耗时的。这一技术可以应用到其他组织中,如心脏和肾脏。 DEVD-AMC可以通过其它基片代替,以测量其他胱天蛋白酶的活性。
胱天蛋白酶或半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶是一个家族参与各种稳态processess 1中的酶。胱天蛋白酶可以根据其在细胞凋亡或炎症中的作用被广义地分类。胱天蛋白酶-1,-4,-5和-12参与炎症而那些从事凋亡可以分划为引发剂胱天蛋白酶(胱天蛋白酶-8,-9)和胱天蛋白酶刽子手(胱天蛋白酶-3,-6和-7 )。
胱天蛋白酶在许多病理发挥显著的作用,主要表现在疾病,其中细胞凋亡能量过大,心肌梗死(MI)或脑缺血后观察到。
在我们的实验中使用的MI后综合征的大鼠模型中,经确定的caspase-3不仅在心肌2而且在其中牵涉情绪和情感3-6的控制边缘系统激活。它还可以看出,caspase-3的不同区域被激活边缘系统,例如杏仁核和海马,以及局部缺血损伤后4约3天内,活化的峰。有趣的是,caspase-3的活性与心肌梗死后的行为障碍,并通过药理和营养干预其衰减减少这些伤害,提示caspase-3和心梗后抑郁7-12之间可能存在的联系。
Caspase-3的活化可通过各种技术来测量。 Western印迹台确定胱天蛋白酶的酶活性,可检测活性酶以及它们的酶原形式。 Western印迹,但是,是半定量,和小的变化可以通过微弱的信号-噪声比13丢失。更好的方法是基于在基板(DEVD-AMC)的由胱天蛋白酶-3,释放一个荧光化合物,并且可以通过荧光分光光度法测量的裂解。 Caspase-3的活化是凋亡的可靠指标。细胞凋亡钙的测定n为不稳定的,因为发生的时间窗口短,和邻近细胞可以吞噬凋亡小体或细胞14。凋亡可以通过其它技术,如末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定法来进一步证实,其检测从凋亡信号传导级联6,或亲/抗凋亡蛋白的比率,如Bax的/得到的DNA片段BCL2 6。
我们与此协议在过去10年的经验导致了关键的方法问题的鉴定。首先,在碎冰上培养皿快速大脑解剖重要的是要保持制剂的质量。第二,必须认识到,组织超声处理较短的脑杏仁核相对于其他类型的组织,如心脏(10秒)或肾脏(20秒)。第三,大应注意在添加到样品之前仔细混合基板。我们遇到变量信号当混合顺序是不充分的。第四,读取样品时无气泡应该存在于石英池中。否则,该信号可能被改变。
我们提出在过去的几年中的变化,以增加可重复性的结果:增加衬底体积,以避免体积小于1微升。仍然,小变化可以连续测定之间发生,和至少3个对照样品应当用于控制的变化。这些控件的荧光措施被平均,平均为100%。实验样品在荧光措施转化在对照样品的百分比。
该技术的另一个限制是,组织只有一部分使用,因此,caspase-3的活性可能被低估。事实上,细胞凋亡的时间窗口短于任何给定的细胞,即使它出现在相邻区域处的采样1,4,15的时间可能被错过。反过来也是可能的:细胞凋亡可能是在组织中的某些部分特别强烈,导致胱天蛋白酶-3活性的高估。我们建议使用剩余的组织(杏仁核)的互补性技术,如TUNEL法或Bax蛋白/ Bcl2的比例(参见导言)的。
荧光分析法具有至少两个优点Western印迹。首先,它直接生成的量化数据。第二,它可以测量酶促一个ctivity本身而不是蛋白质或RNA的表达,这可能是不相关的,并且已知的是蛋白表达可以在没有中酶活性的任何变化增加。此外,荧光分光光度法可以在其它组织或用不同的动物物种中进行,并且可以为其它蛋白酶亚型进行调节,以不同的底物,从而使安全可以用比较的。
总之,本文件说明了如何使用荧光分光光度法来测量胱天蛋白酶-3活性在杏仁核,提供凋亡发生在边缘系统的这个区域的MI后3天的证据。
The authors have nothing to disclose.
这个工作是由自然科学和加拿大金吉尔伯特工程研究理事会资助项目拥有全宗德追忆魁北克一个助学金-桑特。
Spectroflurometer | Photon technology Instrument (now Horiba) | Ratiomaster M-40 | with DeltaRAM Random Access Monochromator |
Respirator | Harvard apparatus | 683 | small animal ventilation |
Glass cuvette | NSG precision cells | 3G10 | Optical Glass (340-2,500nm) 10 mm path |
Sonicator | Cole Parmer | 4710 series | |
Spectrometer | Varian | Cary 50 Bio |