The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.
व्यक्तिगत रूप से भरकर रखा microvessels की पारगम्यता गुणों को मापने के लिए प्रयोगों सुसंस्कृत endothelial सेल monolayers और पूरे microvascular बेड के कार्यात्मक विनिमय गुण में संवहनी पारगम्यता को विनियमित करने आणविक और सेलुलर तंत्र की जांच के बीच एक सेतु प्रदान करते हैं। Cannulate और चूहा अन्त्रपेशी की venular microvessels छिड़कना और microvessel दीवार के हाइड्रोलिक चालकता को मापने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। जरूरत मुख्य उपकरण तीन अलग-अलग microtools की स्थिति के लिए micromanipulators का समर्थन करता है कि एक बड़े संशोधित मंच के साथ एक intravital खुर्दबीन में शामिल हैं: (1) एक beveled कांच micropipette cannulate और microvessel छिड़कना; (2) एक गिलास सूक्ष्म occluder क्षणिक छिड़काव ब्लॉक और एक मापा हीड्रास्टाटिक दबाव में transvascular जल प्रवाह आंदोलन की माप के लिए सक्षम है, और (3) एक कुंद गिलास छड़ी केन्युलेशन के स्थल पर mesenteric ऊतकों को स्थिर करने के लिए। संशोधित लैंडिस सूक्ष्म रोड़ा techniqUE microvessels भर में इन के रूप में प्रयोगात्मक शर्तों को बदल रहे हैं प्रवाह और हीड्रास्टाटिक और कोलाइड आसमाटिक दबाव अंतर के दोहराया माप सावधानी से नियंत्रित कर रहे हैं सक्षम बनाता भी transvascular द्रव आंदोलन के मार्कर के रूप में कृत्रिम perfusate में निलंबित लाल कोशिकाओं का उपयोग करता है, और। पहले तो परीक्षा perfusates साथ ही microvessel की फिर से केन्युलेशन के बाद, एक नियंत्रण perfusate का उपयोग कर हाइड्रोलिक चालकता के माप इन अच्छी तरह से नियंत्रित परिस्थितियों में microvessel प्रतिक्रिया की तुलना की बनती सकें। संवहनी पारगम्यता को संशोधित करने की उम्मीद आनुवंशिक संशोधनों के साथ चूहों के अन्त्रपेशी में microvessels करने के लिए विधि का विस्तार करने का प्रयास क्योंकि माउस अन्त्रपेशी में लंबे समय तक सीधे और unbranched microvessels के अभाव के गंभीर रूप से सीमित थे, लेकिन इसी तरह की आनुवंशिक संशोधनों के साथ चूहों की हाल की उपलब्धता का उपयोग कर CRISPR / Cas9 प्रौद्योगिकी के साथ साथ वर्णित तरीकों से लागू किया जा सकता है, जहां जांच के नए क्षेत्रों को खोलने की उम्मीद है। </p>
वाहिका में microperfusion आमतौर पर व्यास में कम से कम 40 माइक्रोन एक रक्त वाहिका में एक micropipette के माध्यम से जाना जाता संरचना का एक कृत्रिम perfusate के प्रवाह को नियंत्रित की स्थापना पर जोर देता। perfused पोत अपने सामान्य ऊतक वातावरण में रहता है और केन्युलेशन के समय के लिए जानवर के खून के साथ भरकर रखा जाता है। सीटू microperfusion में वीडियो इमेजिंग या fluorometric तकनीक की एक सीमा के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है जब इन प्रवाह के लिए ड्राइविंग बलों में जाना जाता है और नाड़ी की दीवार के पारगम्यता गुण हो सकता है, जहां की शर्तों के तहत microvessels की दीवारों के पार पानी और घुला हुआ पदार्थ प्रवाह की माप के लिए सक्षम बनाता है सीधे मूल्यांकन किया। इसके अलावा, ऊतकों में microvessel (perfusate और superfusate) के आसपास के तरल पदार्थ की संरचना को नियंत्रित करने से, microvessel पारगम्यता और विनिमय के नियमन ई की एक किस्म को उजागर किया microvessel दीवार बनाने endothelial कोशिकाओं को सक्रिय करने के द्वारा जांच की जा सकती हैxperimental की स्थिति समय के ठीक मापा अवधि (मानव संसाधन के लिए सेकंड) के लिए (एगोनिस्ट, संशोधित छिड़काव की स्थिति, फ्लोरोसेंट संकेतक इंट्रासेल्युलर संरचना और संकेतन को मापने के लिए)। इसके अलावा, बाधा को विनियमित कुंजी सेलुलर आणविक संरचना के Ultrastructural या cytochemical मूल्यांकन पारगम्यता सीधे मापा जाता है, जिसमें एक ही microvessels में जांच की जा सकती है। दृष्टिकोण जिससे सुसंस्कृत endothelial सेल monolayers और बरकरार microvessels में जांच में endothelial बाधा समारोह को संशोधित करने के लिए सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच के बीच एक पुल का निर्माण करती है। आगे मूल्यांकन 1-6 निम्नलिखित समीक्षाएं देखें।
Microperfusion की एक सीमा है कि यह केवल, पतली पारदर्शी होते हैं और एक गिलास micropipette के साथ केन्युलेशन सक्षम करने के लिए पर्याप्त संरचनात्मक अखंडता है कि microvascular बेड में इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रारंभिक जांच अन्त्रपेशी और पतली त्वचा संबंधी पेक्टोरिस मीटर में मेंढक microvessels का इस्तेमाल किया जबकि7.8 uscle, दूर से स्तनधारी मॉडल में सबसे अधिक इस्तेमाल तैयारी चूहा अन्त्रपेशी 9-15 है। अधिकांश जांच के 1-4 घंटे की अवधि में अध्ययन किया संवहनी पारगम्यता में तीव्र परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन अधिक हाल ही में जांच के लिए एक प्रारंभिक छिड़काव 12,16 के बाद अलग-अलग जहाजों पर माप के लिए 24-72 घंटा बढ़ा दिया गया है। इस संचार में वर्णित विधि सक्षम होना चाहिए संवहनी पारगम्यता विनियमन 17 के अध्ययन के लिए अधिक आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहे मॉडल उपलब्ध बनाने के लिए वादा किया है जो हाल ही में विकसित CRISPR प्रौद्योगिकी, इन महत्वपूर्ण नए चूहे मॉडल में अन्त्रपेशी की venular microvessels में लागू किया जाएगा।
विधि perfused पोत के करीब है और पोत के साथ एक छिड़काव micropipette के लिए पंक्ति में स्थिति microtools करने के लिए इस्तेमाल जानवर तैयारी और कम से कम तीन micromanipulators दोनों पकड़ काफी बड़े एक कस्टम बनाया खुर्दबीन मंच के साथ सुसज्जित एक औंधा माइक्रोस्कोप की आवश्यकतालुमेन। उदाहरण के लिए एक XY खुर्दबीन मंच (लगभग 90 × 60 सेमी) के लिए एक कस्टम मंच एक जंग सबूत कोटिंग के साथ एक 1 सेमी मोटी स्टील प्लेट से निर्मित किया जा सकता है। मंच के एक इंजीनियरिंग सूचकांक तालिका या क्षैतिज प्लेन में आंदोलन के लिए Teflon खंभे या गेंद स्थानान्तरण पर सही कोण पर मुहिम शुरू की और समर्थित दो कबूतर पूंछ स्लाइड से जुड़ा हुआ है। एक ठेठ रिग (देखें चित्र 2) संवहनी चिकनी की एकल पोत रक्त प्रवाह और hematocrit, खून भरकर रखा microvessels द्वारा स्थानीय ऑक्सीजन वितरण, विनियमन को मापने के लिए ऐसे लोगों के रूप intravital microcirculation में प्रयोगों की एक श्रृंखला के लिए इस्तेमाल माइक्रोस्कोप और micropositioning उपकरणों के साथ आम में ज्यादा है मांसपेशियों टोन, और पूरे संचलन में इंजेक्शन फ्लोरोसेंट ट्रेसर की स्थानीय microvascular संचय। 18-26
तकनीक की मूलभूत पहलू microvessel दीवार का एक परिभाषित सतह क्षेत्र (एस) के पार मात्रा प्रवाह (जे वी) की माप है। पूरा करने के लिएइस के साथ साथ वर्णित संशोधित लैंडिस तकनीक के माध्यम से एक सरल औंधा माइक्रोस्कोप के लिए पर्याप्त है। एक छोटा सा वीडियो कैमरा एक जोड़ा समय आधार के साथ एक वीडियो मॉनीटर पर प्रदर्शित किया जाता है और एक कंप्यूटर पर डिजिटल रूप में या एक वीडियो रिकॉर्डर पर एक डिजिटल या एनालॉग सिग्नल के रूप में या तो दर्ज की, छवि बंदरगाह और वीडियो संकेत पर मुहिम शुरू की है। Microvessel cannulated हो जाने के बाद कैमरे को दिखाई microvessel के हिस्से केन्युलेशन बाधा पहुँचा के बिना एक इकाई के रूप में मंच और manipulators चलती द्वारा बदला जा सकता है।
Transvascular प्रवाह के मापन भी इस तरह घुला हुआ पदार्थ पारगम्यता, साइटोप्लास्मिक कैल्शियम या अन्य सेलुलर तंत्र, और confocal इमेजिंग 6,12,13 के फ्लोरोसेंट अनुपात निगरानी की माप के लिए इस्तेमाल रिसाव के रूप में उपयुक्त फिल्टर के साथ एक परिष्कृत प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग अधिक विस्तृत जांच के साथ जोड़ा जा सकता है 27। सभी microperfusion दृष्टिकोण की एक प्रमुख लाभ ही पोत पर दोहराया उपायों बनाने की क्षमता है,, इस तरह के हीड्रास्टाटिक और oncotic दबाव, या भड़काऊ शर्तों को पोत प्रतिक्रियाओं में प्रेरित परिवर्तन के रूप में बल ड्राइविंग के नियंत्रित परिवर्तन के तहत। सबसे आम डिजाइन एक दूसरे विंदुक के साथ तो एक आधारभूत पारगम्यता राज्य की स्थापना के लिए पहली बार एक नियंत्रण perfusate और लाल सेल निलंबन के साथ भरा एक micropipette के माध्यम से भरकर रखा पोत के साथ ही पोत पर मापा हाइड्रोलिक चालकता (एल पी) के एक बनती तुलना है परीक्षण एजेंट के साथ perfusate के लिए कहा। एकाधिक cannulations नियंत्रण पिपेट साथ reperfusion के बाद दोहराया चक्र के साथ संभव हो रहे हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल microvessel दीवार के पार पानी अपशिष्टों रिकॉर्ड और पोत दीवार के एल पी बरकरार भर में पानी और विलेय के लिए आम मार्ग की पारगम्यता का एक उपयोगी सूचकांक को मापने के लिए चूहा अन्त्रपेशी में एक venular पोत के केन्युलेशन और microperfusion दर्शाता endothelial बाधा। प्रक्रिया संशोधित लैंडिस techniq कहा जाता हैUE क्योंकि 28 संरक्षित है अवरुद्ध है छिड़काव के बाद transvascular द्रव मुद्रा का एक उपाय के रूप में लाल कोशिकाओं के रिश्तेदार आंदोलन का उपयोग करने का मूल लैंडिस सिद्धांत है, लेकिन प्रयोगात्मक शर्तों की सीमा (जैसे, microvessel दीवार के पार हीड्रास्टाटिक और एल्बुमिन oncotic दबाव मतभेद) microperfusion के बाद उपलब्ध uncannulated खून भरकर रखा microvessels 8,29 की तुलना में कहीं अधिक है।
पोत को स्वतंत्र रूप से भरकर रखा जाता है, जबकि transvascular द्रव आंदोलन होता है हालांकि एल पी गणना का विवरण।, ऐसी विनिमय यह पोत छिड़काव दर के कम से कम 0.01% आमतौर पर है क्योंकि मुक्त छिड़काव के दौरान मापा जा द?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम के स्वास्थ्य अनुदान HL44485 और HL28607 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया।
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE | |||
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example | Olympus | CK-40 | try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators |
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example | Leica | DMIL | try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators |
narrow diameter, long working distance objective: example | Nikon | Nikon E Plan 10×/0.25 LWD | |
stage platform–1/2 inch or 1 cm sheet steel | welding shop | this should be heavy to reduce vibration | |
Unislide x-y table: dove tail slides | Velmex | AXY4006W1 | |
VIDEO | |||
CCD video camera: example | Pulnix | TM-7CN (no longer available) | no color needed |
video capture system with audio–generic | |||
video playback system (completely still frame, single frame motion) | |||
small microphone | |||
MICROMANIPULATORS, HOLDERS | |||
micromanipulator, XYZ (3) | Prior/Stoelting (no longer available) | look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning | |
hydraulic probe drive, one way | FHC | 50-12-1C | need to buy either manual drive or electronic drive |
manual drum drive | FHC | 50-12-9-02 | |
or hydraulic drive, 3 way | Siskiyou Corporation | MX610 (1-way) or MX630 (3-way) | great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years |
connectors/rods/holders | Siskiyou Corporation | MXC-2.5, MXB etc. | |
pin vise | Starrett | 162C | to hold restrainer |
pipette holder | World Prescision Instruments | MPH3 | |
water manometer ~120 cm | |||
MICROSCOPE TRAY | |||
clear Plexiglas for microscope tray for animal | |||
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall | Quartz Scientific Inc. | custom | (or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective |
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN) | |||
medical adhesive for tissue well | NuSil | MED-1037 | |
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W | Cole Parmer | EW-03125-20 | heater for microscope tray–needs cord and controller–240V version available |
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC | Cole Parmer | EW-03122-75 | |
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out | Cole Parmer | EW-01575-00 | |
PIPET MANUFACTURE | |||
vertical pipette puller | Sutter Instrument Company | P-30 with nichrome filament | |
1.5 mm OD thin wall capillary tubing | Sutter Instrument Company | B150-110-10 | |
pipette grinder air stone and dissection microscope–see reference in text | or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments | ||
RX Honing Machine, System II | RX Honing Machine Corporation | MAC-10700 Rx System II Machine | alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle |
with ceramic sharpening disc | RX Honing Machine Corporation | use "as is" or attach lapping film | |
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um | 3M | part no. 051144 80827 | 268X Imperial lapping film sheets with adhesive back–can be purchased from Amazon |