Şekilde, mikro Tekniği Sıçan mezenter mikrodamar geçirgenliği Yönetmelik Araştırma
Summary
The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.
Abstract
Bireysel perfüze mikrodamarlar geçirgenlik özelliklerini ölçmek için deneyler kültürlü endotel hücre mono tabakaları ve tüm mikrovasküler yatak fonksiyonel değişim özelliklerinde damar geçirgenliğini düzenleyen moleküler ve hücresel mekanizmaların araştırılması arasında bir köprü oluştururlar. Kanül ve sıçan mezenter venüler mikrodamarlar serpmek mikrodamar duvarının hidrolik iletkenliği ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Gerekli temel ekipmanları üç farklı microtools konumlandırmak için mikromanipülatörler destekleyen büyük bir modifiye sahne ile bir intravital mikroskop içerir: (1) bir eğimli cam mikropipet cannulate ve mikrodamar serpmek için; (2) bir cam mikro-tıkayıcı geçici perfüzyon blok ve ölçülü bir hidrostatik basınçta transvasküler su akış hareketinin ölçülmesine olanak tanıyan, ve (3) kör bir cam çubuk kanül yerinde mezenterik doku dengelenmesi için. Modifiye Landis mikro oklüzyon technique mikrodamarlar karşısında bu kadar deneysel koşullar değiştiğinde akımları ve hidrostatik ve kolloid osmotik basınç farkı tekrarlanan ölçümler titizlikle kontrol edilir kılar da transvasküler sıvı hareketinin belirteçleri olarak yapay perfüzat içinde asılı kırmızı hücreleri kullanır ve. Sonra ilk deneme Perfüzatlar aynı mikro damarın yeniden kanülasyondan sonra, bir kontrol perfüzyon kullanarak hidrolik iletkenlik ölçümleri bu iyi kontrollü koşullar altında mikrovasküler yanıt karşılaştırmalar eşleştirilmiş etkinleştirin. Vasküler geçirgenliği değiştirmek için beklenen genetik değişiklikler ile farelerin mezenterinde mikrodamarlar yöntemi genişletmek için girişimleri nedeniyle fare mezenterinde uzun düz ve dalsız mikrodamarlar yokluğu ciddi sınırlı, ama benzer genetik değişikliklerle sıçanların son durumu kullanarak CRISPR / Cas9 teknolojisi burada tarif edilen yöntemler uygulanabilir soruşturmanın yeni alanlar açılması bekleniyor. </p>
Introduction
Damar sisteminde sayılı Şekilde, mikro çapı genellikle 40 um den az bir kan damarının bir mikropipet vasıtasıyla bilinen bir bileşimin, yapay bir perfüzat akışını kontrol kuran gerektirir. Perfüze gemi normal doku ortamında kalır ve Kanülasyonu zaman hayvanın kanı yukarı ile perfüze. In situ sayılı Şekilde, mikro video görüntüleme veya florometrik bir dizi teknik ile bağlantılı olarak kullanıldığında bu akışları için itici güçler bilinmektedir ve vasküler duvarın geçirgenlik özellikleri olabilir koşullar altında mikro damarların duvarları arasında, su ve çözünmüş madde akımlarının ölçümü sağlar doğrudan değerlendirildi. Bundan başka, doku mikrodamar (perfüze ve superfusate), çevreleyen sıvı bileşimlerini kontrol ederek, mikrovasküler geçirgenliğin ve değişim düzenlenmesi e maruz bırakılmış olan mikrodamar duvarı oluşturan endotelial hücreler sağlayarak araştırılabilirXperimental koşullar zaman tam ölçülen süreler (saat sn) için (agonistler, modifiye perfüzyon koşulları, floresan göstergeler içi kompozisyon ve sinyalizasyon ölçmek için). Buna ek olarak, bariyer düzenleyen önemli hücresel molekül yapılarının ultrastrüktürel ya sitokimyasal değerlendirmeler geçirgenliği ile doğrudan ölçüldüğü aynı Mikro damarların içinde araştırılabilir. Yaklaşım ve böylece kültürlü endotel hücre mono tabakaları ve bozulmamış mikrodamarlar soruşturma endotel bariyer fonksiyonunu değiştirmek için hücresel ve moleküler mekanizmalar soruşturma arasında bir köprü oluşturmaktadır. Daha fazla değerlendirme 1-6 aşağıdaki bakın.
Şekilde, mikro bir sınırlaması, sadece ince, saydam ve bir cam mikropipet ile kanülasyon mümkün kılmak için yeterli yapısal bütünlüğe sahip mikrovasküler yatak kullanılabilir olmasıdır. Erken araştırmalar mezenter ve ince deri pektoris m kurbağa mikrodamarlar kullanılır iken7,8 uscle, bugüne kadar memeli modellerinde en sık kullanılan hazırlama sıçan mezenter 9-15 olduğunu. Çoğu araştırmalar 1-4 saatlik sürelerde çalışılan damar geçirgenliği akut değişiklikler üzerinde duruldu, ama daha yeni araştırmalar bir başlangıç perfüzyon 12,16 sonra bireysel damarlarda ölçümler 24-72 saat genişletilmiştir. Bu iletişimde açıklanan yöntemleri etkinleştirmeniz gerekir vasküler geçirgenlik yönetmelik 17 eğitim için daha genetiği değiştirilmiş fare modelleri kullanılabilir hale getirmek için söz yeni geliştirilen CRISPR teknolojisi, bu yeni ve önemli sıçan modellerinde mezenterin venüler mikrodamarlar uygulanacak.
Yöntem perfüze gemiye yakın ve geminin bir perfüzyon mikropipet hizalamak için pozisyon microtools için kullanılan hayvan hazırlama ve en az üç mikromanipülatörler hem alacak kadar büyük bir özel inşa mikroskop aşaması ile donatılmış bir inverted mikroskop gerektirirlümen. Örneğin, bir xy mikroskop sahnede (yaklaşık 90 × 60 cm) için özel bir platform pas geçirmez kaplama ile 1 cm kalınlığında çelik levha imal edilebilir. Sahne, bir mühendislik dizin tablosunun veya yatay düzlemde hareket için Teflon sütunlar ya da Bilya üzerinde dik açılarda monte edilir ve desteklenen iki kırlangıç kuyruğu slaytlar takılır. Tipik bir teçhizat (Şekil 2), vasküler düz tek damar kan akışını ve hematokrit, kan perfüze mikrodamarlar yerel oksijen teslimat, yönetmelik ölçmek için böyle olanlar gibi intravital mikrodolaşım deneyler bir dizi için kullanılan mikroskop ve micropositioning ekipmanları ile ortak çok şey var kas tonu, ve bütün dolaşıma enjekte floresan izleyiciler yerel mikrovasküler birikimi. 18-26
Tekniğin temel yönü mikrodamar duvarının belirlenmiş bir yüzey alanı (S) boyunca hacimsel akış (J v) ölçülmesidir. BaşarmakBu, burada açıklanan modifiye Landis tekniği ile basit bir ters mikroskop yeterlidir. Küçük bir video kamera ilave bir zaman baz ile, bir video monitöründe gösterildi ve bir bilgisayara bir dijital formda veya bir video kayıt cihazı üzerinde dijital veya analog bir sinyal olarak kaydedilebilirler, görüntü portu ve video sinyali üzerine monte edilir. Mikrodamar kanüle sonra kamera görülebilir mikro damarın kısmı kanülasyonu bozmadan bir birim olarak sahne ve manipülatörler taşıyarak değiştirilebilir.
Transvasküler akımlarının ölçümü aynı zamanda, çözünmüş madde geçirgenliği, sitoplazmik kalsiyum ya da diğer hücresel mekanizmaları ve konfokal görüntüleme 6,12,13 floresan oranı izleme ölçümleri için kullanılan donanımları olarak uygun filtreler ile gelişmiş bir floresans mikroskobu kullanılarak daha ayrıntılı inceleme ile birleştirilebilir 27. Tüm Şekilde, mikro yaklaşımların önemli bir avantajı, aynı gemide tekrarlanan tedbirleri yapabilme yeteneği olduğunuGibi hidrostatik ve onkotik basınçları, ya da iltihabi durumların damar yanıtlarında kaynaklı değişim olarak itici güç kontrollü değişim altında. En yaygın tasarım, ikinci bir pipet ile, daha sonra bir taban çizgisi geçirgenliği durumunu tesis eden ilk bir kontrol perfüzat ve eritrosit süspansiyonu ile doldurulmuş bir mikropipet ile perfüze gemi ile aynı kap üzerinde ölçülen hidrolik iletkenliği (L p), bir çift karşılaştırmasıdır Test maddesi ile perfüzat ilave edildi. Birden kanülasyonlar kontrol pipet ile reperfüzyon sonra tekrar çevrimi ile mümkündür.
Bu protokol, mikrodamar duvarı boyunca su akıları kayıt ve damar duvarının L p, sağlam boyunca su ve çözünen maddelerin ortak yolunun geçirgenliği yararlı bir kırılma indeksinin ölçülmesi için sıçan mezenter bir venüler kabın kanül ve Şekilde, mikro göstermektedir endotel bariyer. Prosedür modifiye Landis techniq adlandırılırue, çünkü 28 korunur bloke perfüzyona başlanmasından transvasküler sıvı alışverişi bir ölçüsü olarak, kırmızı hücrelerin göreceli hareketlerini kullanarak orijinal Landis prensibi ancak deneysel koşullar aralığı (örneğin, mikro-damar duvarı boyunca hidrostatik albumin onkotik basınç farkları) Şekilde, mikro sonra kullanılabilir uncannulated kan perfüze mikrodamarlar 8,29 oranla çok daha fazladır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gemi serbestçe perfüze iken transvasküler sıvı hareketi meydana rağmen L p hesaplamaları Detayları., Böyle bir değişim damar perfüzyon oranının% 0.01'den az, genellikle, çünkü serbest perfüzyon sırasında ölçülecek kadar çok küçük. Perfüzyon geçici mikrodamar, transvasküler akışını kapatılmasıy durdurulur Ancak, (yani, filtrasyon) 'de gösterildiği kısaltır gibi işaretleyici kırmızı hücre ve tıkanma sitenin arasında sıvı sütun olarak l?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Sağlık yardımları HL44485 ve HL28607 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| MICROSCOPE, TABLE AND STAGE | |||
| inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example | Olympus | CK-40 | try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators |
| inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example | Leica | DMIL | try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators |
| narrow diameter, long working distance objective: example | Nikon | Nikon E Plan 10×/0.25 LWD | |
| stage platform–1/2 inch or 1 cm sheet steel | welding shop | this should be heavy to reduce vibration | |
| Unislide x-y table: dove tail slides | Velmex | AXY4006W1 | |
| VIDEO | |||
| CCD video camera: example | Pulnix | TM-7CN (no longer available) | no color needed |
| video capture system with audio–generic | |||
| video playback system (completely still frame, single frame motion) | |||
| small microphone | |||
| MICROMANIPULATORS, HOLDERS | |||
| micromanipulator, XYZ (3) | Prior/Stoelting (no longer available) | look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning | |
| hydraulic probe drive, one way | FHC | 50-12-1C | need to buy either manual drive or electronic drive |
| manual drum drive | FHC | 50-12-9-02 | |
| or hydraulic drive, 3 way | Siskiyou Corporation | MX610 (1-way) or MX630 (3-way) | great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years |
| connectors/rods/holders | Siskiyou Corporation | MXC-2.5, MXB etc. | |
| pin vise | Starrett | 162C | to hold restrainer |
| pipette holder | World Prescision Instruments | MPH3 | |
| water manometer ~120 cm | |||
| MICROSCOPE TRAY | |||
| clear Plexiglas for microscope tray for animal | |||
| 3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall | Quartz Scientific Inc. | custom | (or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective |
| Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN) | |||
| medical adhesive for tissue well | NuSil | MED-1037 | |
| All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W | Cole Parmer | EW-03125-20 | heater for microscope tray–needs cord and controller–240V version available |
| Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC | Cole Parmer | EW-03122-75 | |
| STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out | Cole Parmer | EW-01575-00 | |
| PIPET MANUFACTURE | |||
| vertical pipette puller | Sutter Instrument Company | P-30 with nichrome filament | |
| 1.5 mm OD thin wall capillary tubing | Sutter Instrument Company | B150-110-10 | |
| pipette grinder air stone and dissection microscope–see reference in text | or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments | ||
| RX Honing Machine, System II | RX Honing Machine Corporation | MAC-10700 Rx System II Machine | alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle |
| with ceramic sharpening disc | RX Honing Machine Corporation | use "as is" or attach lapping film | |
| lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um | 3M | part no. 051144 80827 | 268X Imperial lapping film sheets with adhesive back–can be purchased from Amazon |
References
- Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the ‘squid axon’ of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
- Curry, F. R., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
- Curry, F. R., Adamson, R. H. Tonic regulation of vascular permeability. Acta physiologica. 207, 628-649 (2013).
- Michel, C. C. Fluid exchange in the microcirculation. The Journal of physiology. 557, 701-702 (2004).
- Tarbell, J. M., Simon, S. I., Curry, F. R. Mechanosensing at the vascular interface. Annual review of biomedical engineering. 16, 505-532 (2014).
- Sarelius, I. H., Kuebel, J. M., Wang, J., Huxley, V. H. Macromolecule permeability of in situ and excised rodent skeletal muscle arterioles and venules. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 290, H474-H480 (2006).
- Curry, F. E., Frokjaer-Jensen, J. Water flow across the walls of single muscle capillaries in the frog, Rana pipiens. The Journal of physiology. 350, 293-307 (1984).
- Michel, C. C., Mason, J. C., Curry, F. E., Tooke, J. E., Hunter, P. J. A development of the Landis technique for measuring the filtration coefficient of individual capillaries in the frog mesentery. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 59, 283-309 (1974).
- Adamson, R. H., Zeng, M., Adamson, G. N., Lenz, J. F., Curry, F. E. PAF- and bradykinin-induced hyperpermeability of rat venules is independent of actin-myosin contraction. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 285, H406-H417 (2003).
- Huxley, V. H., Rumbaut, R. E. The microvasculature as a dynamic regulator of volume and solute exchange. Clinical and experimental pharmacology, & physiology. 27, 847-854 (2000).
- Rumbaut, R. E., Wang, J., Huxley, V. H. Differential effects of L-NAME on rat venular hydraulic conductivity. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , 279-H2023 (2000).
- Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of applied physiology. 113, 1110-1120 (2012).
- Zhou, X., He, P. Temporal and spatial correlation of platelet-activating factor-induced increases in endothelial [Ca(2)(+)]i, nitric oxide, and gap formation in intact venules. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 301, H1788-H1797 (2011).
- Adamson, R. H., et al. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels. The Journal of physiology. 557, 889-907 (2004).
- Adamson, R. H., et al. Epac/Rap1 pathway regulates microvascular hyperpermeability induced by PAF in rat mesentery. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2008).
- Curry, F. E., Zeng, M., Adamson, R. H. Thrombin increases permeability only in venules exposed to inflammatory conditions. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2003).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature. 32, 347-355 (2014).
- Bagher, P., Davis, M. J., Segal, S. S. Intravital macrozoom imaging and automated analysis of endothelial cell calcium signals coincident with arteriolar dilation in Cx40(BAC) -GCaMP2 transgenic mice. Microcirculation. 18, 331-338 (2011).
- Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. The Journal of physiology. 555, 459-469 (2004).
- Oshiro, H., et al. L-type calcium channel blockers modulate the microvascular hyperpermeability induced by platelet-activating factor in vivo. Journal of vascular surgery. 22, 732-739 (1995).
- Chen, W., et al. Atrial natriuretic peptide-mediated inhibition of microcirculatory endothelial Ca2+ and permeability response to histamine involves cGMP-dependent protein kinase I and TRPC6 channels. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 33, 2121-2129 (2013).
- Harris, N. R., Whitt, S. P., Zilberberg, J., Alexander, J. S., Rumbaut, R. E. Extravascular transport of fluorescently labeled albumins in the rat mesentery. Microcirculation. 9, 177-187 (2002).
- Yuan, W., Li, G., Zeng, M., Fu, B. M. Modulation of the blood-brain barrier permeability by plasma glycoprotein orosomucoid. Microvascular research. 80, 148-157 (2010).
- Sugiura, Y., Morikawa, T., Takenouchi, T., Suematsu, M., Kajimura, M. Cilostazol strengthens the endothelial barrier of postcapillary venules from the rat mesentery in situ. Phlebology / Venous Forum of the Royal Society of Medicine. 29, 594-599 (2014).
- Guo, M., et al. Fibrinogen-gamma C-terminal fragments induce endothelial barrier dysfunction and microvascular leak via integrin-mediated and RhoA-dependent mechanism. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29, 394-400 (2009).
- Dewar, A. M., Clark, R. A., Singer, A. J., Frame, M. D. Curcumin mediates both dilation and constriction of peripheral arterioles via adrenergic receptors. The Journal of investigative dermatology. 131, 1754-1760 (2011).
- Lee, J. F., et al. Balance of S1P1 and S1P2 signaling regulates peripheral microvascular permeability in rat cremaster muscle vasculature. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 296, H33-H42 (2009).
- Landis, E. M. Microinjection studies of capillary permeability. II. The relation between capillary pressure and the rate at which fluid passes through the walls of single capillaries. Am J Physiol. 82, 217-238 (1927).
- Curry, F. E., Huxley, V. H., Sarelius, I. H., Linden, R. J. . Techniques in cardiovascular physiology Part 1. P3/1, 1-34 (1983).
- Vurek, G. G., Bennett, C. M., Jamison, R. L., Troy, J. L. An air-driven micropipette sharpener). J Appl Physiol. 22, 191-192 (1967).
- Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Erythrocyte-derived sphingosine-1-phosphate stabilizes basal hydraulic conductivity and solute permeability in rat microvessels. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 303, H825-H834 (2012).
- Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Adamson, R. H., et al. Attenuation by sphingosine-1-phosphate of rat microvessel acute permeability response to bradykinin is rapidly reversible. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 302, H1929-H1935 (2012).
- Bates, D. O. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability. Cardiovasc Res. 87, 262-271 (2010).
- Adamson, R. H., et al. Rho and rho kinase modulation of barrier properties: cultured endothelial cells and intact microvessels of rats and mice. The Journal of physiology. 539, 295-308 (2002).
- Curry, F. R., et al. Atrial natriuretic peptide modulation of albumin clearance and contrast agent permeability in mouse skeletal muscle and skin: role in regulation of plasma volume. The Journal of physiology. 588, 325-339 (2010).
- Neal, C. R., Bates, D. O. Measurement of hydraulic conductivity of single perfused Rana mesenteric microvessels between periods of controlled shear stress. The Journal of physiology. 543, 947-957 (2002).
- Adamson, R. H., et al. Albumin modulates S1P delivery from red blood cells in perfused microvessels: mechanism of the protein effect. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 306, H1011-H1017 (2014).
- Huxley, V. H., Wang, J. J., Sarelius, I. H. Adaptation of coronary microvascular exchange in arterioles and venules to exercise training and a role for sex in determining permeability responses. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 293, H1196-H1205 (2007).
- Huxley, V. H., Williams, D. A. Basal and adenosine-mediated protein flux from isolated coronary arterioles. Am J Physiol. 271, H1099-H1108 (1996).
- Davis, M. J., Gore, R. W. Double-barrel pipette system for microinjection. Am J Physiol. 253, H965-H967 (1987).
- Adamson, R. H., et al. Sphingosine-1-phosphate modulation of basal permeability and acute inflammatory responses in rat venular microvessels. Cardiovasc Res. 88, 344-351 (2010).
- Zeng, Y., Adamson, R. H., Curry, F. R., Tarbell, J. M. Sphingosine-1-phosphate protects endothelial glycocalyx by inhibiting syndecan-1 shedding. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , H306-H363 (2014).
