AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 체외 세대
Summary
In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.
Abstract
형질 수지상 세포 (올라가고은) 내가 감염 또는 염증 반응 동안 응답 활성화 (IFN-1) 생산 세포를 인터페론 강력한 유형입니다. 불행하게도, PDC 기능의 연구는 림프 기관에 낮은 주파수에 의해 방해하고, 체외 DC 생성을위한 기존의 방법은 주로 올라가고 이상 CDCS의 생산을 선호. 여기에 우리가 효율적으로 체외에서 일반적인 림프 전구 세포 (CLP를)에서 올라가고을 생성하는 독특한 접근 방식을 제시한다. 특히, 프로토콜은 골수로부터 CLP를 정화 및 FLT3 리간드의 존재하에 γ 조사 된 AC-6 피더 세포와 공동 배양함으로써 PDCS를 생성하는 방법을 자세히 설명했다. 이 문화 시스템의 고유 한 특징은 CLP를가 AC-6 세포 아래 마이그레이션 및 조약돌 영역 형성 세포, PDC의 확장을위한 중요한 단계가 될 것입니다. 형태 학적으로 별개의 수지상, 즉 올라가고 및 CDCS는 7 조성 후 약 2 주 생성 된최적 조건 하에서 0-90%의 PDCS. 일반적으로이 방법에 의해 생성 PDCS의 수는 대략 CLP를 시딩 수의 100 배이다. 따라서, 이것은 견고 이들 세포의 발달 및 기능에 추가 연구를 용이하게하기 위해 필요한 PDCS의 다수를 생성되는 신규 한 시스템이다.
Introduction
수지상 세포 (DCS)는 면역 반응 1을 제어하는데 중요한 역할을 전문 항원 제시 세포이다. DC가 이종 있지만, 그들이 대체로 두 집단으로 분류 될 수 있고, 종래의 DC (CDCS) 및 형질 수지상 (PDCS) 2,3-. 림프 기관 외에 CDCS 및 PDCS 또한 폐, 소장, 피부 (2)를 포함한 조직에서 발견된다. CDCS 및 올라가고의 형태는 수상 돌기 모양의 돌기보다 형질 세포가 같은 것을 올라가고의 모양을 나타내는 CDCS으로 다르다. 또한, 일반적인 마우스 DC 마커, CD11c 양성은 더 높게 올라가고보다 CDCS에 표현된다. 올라가고 2보다 MHC 클래스 II의 높은 수준과 보조 자극 분자를 표현 둘 CD24 + CDCS, – CDCS와 CD11b를 – 또한, CDCS는 더는 CD11b + CD24로 나눌 수 있습니다. 성숙한 PDCS는 반면에, 선택적 Siglec-H 및 BST2 4를 발현하는 것으로 나타났다. 에프unctionally, CDCS는 올라가고보다 제시 세포보다 항원은; 그러나 올라가고 내가 바이러스 감염이나 염증 자극 5시 인터페론 유형의 광대 한 양을 생성 할 수 있습니다.
모두 CDCS 및 올라가고는 짧은 수명이며, 따라서 지속적으로 골수 (BM) 6,7 내 조상에서 보충해야합니다. 치명적-조사 된 마우스에 공통 골수 전구 세포 (CMP들) 및 일반 림프 조상 (CLP를)의 입양 전송 CDCS과 올라가고 양쪽 계통 8-10에서 생성 될 수 있음을 보여줍니다. 그러나, RAG1 / 2를 표현하고 고등학교의 궤적 (11, 12)에서 재 배열 DJ 세그먼트를 가지고 올라가고의 부분 집합이있다. 이 세포는 B220 마커의 발현, 핵산 감지 수용체 (TLR7 / TLR9) 및 전사 인자 (Spib 및 Bcl11a) (13)를 포함하는 B 림프구와 분자 유사성을 공유하고, 림프 혈통의 서명 될 것으로 모두가 있습니다. 따라서, CLPS 때문에 계보 유사성 올라가고의 체외 발생에 대한 좋은 선택 일 수있다.
인간 및 마우스 모두 CDCS 및 PDCS의 빈도가 매우 낮은 반면 6, 수지상 세포, 특히 CDCS는, (예를 GM-CSF 11,14 또는 FLT3 리간드와 같은 사이토 카인의 존재 BM 또는 전구 세포로부터 in vitro에서 생성 될 수있는 FL ) 공급 장치가없는 시스템 11,15,16를 사용하여. 불행하게도, 그러나, FL 11,15,16을 사용하여 시험 관내에서 PDC의 다수를 생성하는 것은 불가능하다. 이전에, 우리는 PDCS 효율적 AC-6 급전 시스템 (17)을 사용하여 시험 관내에서 CLP를 생성 할 수 있다는 것을 보여 주었다. 배양 시스템에서 AC-6 간질 세포주를 사용하는 장점은 세포 – 세포 접촉 CLP를 PDCS로부터 많은 수의 생성을 지원하는 사이토 카인의 분비를 제공한다는 것이다. 이 시스템으로 생산이 매우 강력하지만, 아래에 설명 된 절차에주의 복제 내가 필요합니다N 순서는 올라가고의 효율적 생성을 보장합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 CLP를 소수의에서, 특히 체외 배양 수지상의 강력한 생성을위한 시스템 및 올라가고을 설명합니다. 이 배양 시스템의 고유성은 피더로서 AC-106 세포, 간질 세포주의 이용에 기인한다. 이 방법은 예컨대 IL-7, SCF, M-CSF 및 FL 20뿐만 아니라 사이토 카인을 제공하기 위해 도시 한 내용뿐만 아니라, 필요한 세포 간 접촉 (21)은 DC 개발을 지원한다. AC-106 세포는 여러 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 박사에 감사드립니다. 시약을 제공 마르쿠스 만츠와 어빙 와이즈맨. 우리는 또한 각각 의학 및 NTU 병원의 국립 대만 대학에서 유세포 분석 및 우선의 셀 정렬 핵심 시설과 두 번째 핵심 연구소가 제공하는 서비스를 인정합니다. 이 작품은 과학 기술, 대만의 교육부에 의해 지원되었다 (가장 102-2320-B-002-030-MY3)과 국민 건강 연구소, 대만 (NHRI-EX102-10256SI과 NHRI-EX103-10256SI).
Materials
| Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | linage marker |
| Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | linage marker |
| Anti-mouse CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | linage marker |
| Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | linage marker |
| Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | linage marker/FACS |
| Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | linage marker |
| Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | linage marker |
| Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | linage marker |
| Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | linage marker |
| Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | linage marker |
| Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
| Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
| Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
| Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
| Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
| Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
| FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
| FACS sorting tube | BD Biosciences | 352054 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | Flow analysis sofrware |
References
- Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
- Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
- Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
- Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
- Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
- Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
- D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
- Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
- Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
- Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
- Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
- Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
- Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
- Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
- Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
- Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
- Chen, Y. -. L., Chang, S., Chen, T. -. T., Lee, C. -. K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10 (8), e0135217 (2015).
