VDJ-Seq: ניתוח רצף עמוק של ג'ין שרשרת מחדש Immunoglobulin כבד לחשוף את דפוסים משובטים אבולוציה של לימפומה B הסלולרי
Summary
This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.
Abstract
clonality גידול הבנה הוא קריטי להבנת המנגנונים המעורבים בהתקדמות tumorigenesis ומחלה. בנוסף, הבנת שינויי ההרכב המשובטים המתרחשים בתוך גידול בתגובה למייקרו-סביבה או טיפולים מסוימים עלולה להוביל לעיצוב של גישות יותר מתוחכמות ויעילות למיגור תאים סרטניים. עם זאת, תת-אוכלוסיות משובטים גידול מעקב היו מאתגרות בשל חוסר הסמנים להבחין. כדי לטפל בבעיה זו, פרוטוקול VDJ-seq נוצר כדי להתחקות אחרים דפוסי התפתחות המשובטים של לימפומה B תא הגדולה הישנות מפוזרת (DLBCL) על ידי ניצול רקומבינציה VDJ וhypermutation הגופני (SHM), שתי תכונות ייחודיות של לימפומות תאי B.
בפרוטוקול זה, ספריות רצף של הדור הבא (NGS) עם פוטנציאל לאינדקס נבנו משרשרת מוגברת אימונוגלובולינים מחדש כבדה (IGH) אזור VDJ מזוגות של אבחון ראשוני וSAMP DLBCL הישנותles. על יותר מממוצע חצי מיליון רצפי VDJ למדגם התקבלו לאחר רצף, המכיל שני VDJ התארגנות ומידע SHM. בנוסף, צינורות ביואינפורמטיקה מותאמים אישית פותחו לנצל מידע רצף לאפיון של רפרטואר IGH-VDJ בתוך דגימות אלה באופן מלא. יתר על כן, הצינור מאפשר שחזור והשוואה של הארכיטקטורה המשובט של גידולים בודדים, המאפשרת הבחינה של ההטרוגניות המשובט בתוך גידולי האבחון וניכוי דפוסי התפתחות משובטים בין האבחון וזוגות גידול הישנות. כאשר מיישמים את הניתוח הזה לכמה זוגות אבחון הישנות, אנחנו חשפנו ראיות מרכזיות שדפוסים אבולוציוניים גידול ייחודי מרובים עלולים להוביל לנסיגת DLBCL. בנוסף, גישה זו יכולה להיות מורחבת להיבטים קליניים אחרים, כגון זיהוי של מחלה שיורית מינימאלית, מעקב אחר התקדמות הישנות ותגובה לטיפול, וחקירה של רפרטואר חיסוניes בהקשרים שאינם לימפומה.
Introduction
הסרטן הוא מחלה משובט. מאז לפני שלושים שנה, כאשר פיטר ג Nowell הציע מודל התפתחות הסרטן המשובט 1, מחקרים רבים ניסו לנתח אוכלוסיות משובטים בתוך דגימות גידול ולשחזר דפוסי התרחבות והתפתחות משובטים העומדים בבסיס תהליך יצירת הגידולים 2. לאחרונה, רצף הגנום אפשר חוקרים ליסתכל עמוק בהטרוגניות והאבולוציה 3,4 המשובטים. עם זאת, בשל חוסר סמנים צייתן בסוגי תאים רבים, קשה להסיק ארכיטקטורה משובט המדויקת ומסלול האבולוציוני. למרבה המזל, יש סמן clonality טבעי בתאי B הבוגרים ממנו רבות ממאירות הלימפה, כולל DLBCL, מקורן. בתגובה לגירוי אנטיגן, כל תא B יכול ליצור רצף IGH VDJ יחיד יצרני על ידי הצטרפות H V (משתנה), D (גיוון), וH J (הצטרפות) קטע יחד ממאגר גדול של מגזרים אלו. במהלך יחסי ציבור זהocess, מנות קטנות של הרצף המקורי עשויים להימחק ונוקלאוטידים שאינן בתבניות נוספות ניתן להוסיף ליצור סידור מחדש VDJ ייחודי. סידור מחדש VDJ ספציפי זה יכול להיות בירושה בכל הצאצאים של תאי B זה, ולכן תיוג B-תא בוגר פרט וצאצאיה 5. יתר על כן, SHM מתרחש על רצפי VDJ recombined בתגובה הבאה מרכז נבטי (GC) להציג מוטציות נוספות להרחבת בריכת הנוגדן ושיפור של זיקת נוגדן 6. לכן, על ידי השוואה והנגדה דפוסים של דגימות לימפומה שעברו תהליכים אלה VDJ וSHM, ההטרוגניות תוך גידול יכולה להיות שמסומן ונתיב התפתחות משובט של המחלה ניתן ללמוד.
בעבר, סידור מחדש VDJ וSHM יכולים להיות מזוהה על ידי PCR הגברת אזורי recombined, שיבוט מוצרי ה- PCR, ולאחר מכן רצף סנגר לקבל מידע רצף. אני גישה זוזה נמוך תפוקה ותשואה נמוכה, אחזור רק חלק קטן מרפרטואר VDJ recombined כל, ומעכב את האפיון של הייצוג הכולל של האוכלוסייה המשובט בתוך מדגם נתון. גישה שונה נוצרה על ידי יצירת אינדקס NGS ספריות רצף ממוצרי VDJ PCR וביצוע רצף נ"ב 2×150 PE להשיג יותר מחצי מיליון רצפי VDJ recombined לדגימה. בנוסף, צינור מותאם אישית פותח כדי לבצע בקרת איכות (QC), ליישר, רצף VDJ המסנן קורא לזהות rearrangements וSHMs של כל קריאה, ולבצע ניתוח פילוגנטי על הארכיטקטורה המשובט של כל דגימה. בנוסף, גישה חדשה הוקמה כדי להמשיך ולאפיין את דפוסי התפתחות המשובטים לדגימות שנאספו בשלבי מחלה שונים.
יש לנו ליישם את הטכניקה הזו לדגימות חולה DLBCL. DLBCL הוא צורה אגרסיבית של לימפומה שאינה הודג'קין עם הישנות תכופה בה עד אחדIRD של החולים 7. התקפי DLBCL בדרך כלל להתרחש מוקדם, בתוך 2 עד 3 שנים של האבחון הראשוני, למרות שחלקם מתרחש לאחר 5 שנים 8. הפרוגנוזה של חולי הישנות היא עניה, עם רק 10% השיג 3 שנות הישרדות ללא התקדמות מחלה בשל אפשרויות טיפול מוגבלות. זהו הבסיס לצורך הדחוף בגישות חדשות לטיפול בהישנות DLBCL 9,10. עם זאת, מנגנונים מולקולריים הקשורים בהישנות DLBCL עדיין במידה רבה לא ידועים. במיוחד, התפקיד של ההטרוגניות משובט באבחון ואבולוציה משובט במהלך פיתוח הישנות DLBCL הוא כיום uncharacterized, ולכן קשה להגדיר סמן ביולוגי מדויק ושימושי לחזות הישנות. כדי לענות על שאלות אלה, יישמנו גישת VDJ-הרצף שלנו בזוגות רבים של זוגות מדגם DLBCL אבחון הישנות ראשונית מתאימים. שני תרחישים האבולוציונית משובטים מובהקים של הישנות יצאו מההשוואה של הארכיטקטורות המשובטים בין האבחון וSAMP הישנותles שמציע מנגנונים מולקולריים מרובים עשוי להיות מעורב בהישנות DLBCL.
Protocol
Representative Results
Discussion
בגלל המספר כמעט בלתי מוגבל של חזרות של רצף מידע המקודד על ידי סידור מחדש VDJ וSHM במוקד IGH של תאי B אנושיים, בדיקה של כל רפרטואר IGH ידי תפוקה גבוהה עמוק רצף הוכיחה להיות דרך יעילה ומקיפה להתוות משובט ואוכלוסיות B-תא תת-משובטים. יתר על כן, אסטרטגיה זו יכולה לשמש כדי לחקור את נ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.
Materials
| Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
| TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
| Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 – Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
| IGH Gene Clonality Assay – Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6×1 L |
| 50X TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
| Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
References
- Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
- Greaves, M., Maley, C. C. Clonal evolution in cancer. Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).
- Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).
- Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
- Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
- Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).
- Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).
- Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).
- Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
- Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).
- Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).
- Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15 (8), 432 (2014).
- Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133 (2), 250-264 (2008).
