VDJ-Seq: बी सेल लिंफोमा के क्लोनल विकास पैटर्न प्रकट करने के लिए पुन: व्यवस्थित इम्यूनोग्लोबिन भारी श्रृंखला जीन की गहरी अनुक्रमण विश्लेषण
Summary
This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.
Abstract
समझौता ट्यूमर क्लोनालिटी tumorigenesis और रोग प्रगति में शामिल तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, कुछ सूक्ष्म वातावरण या उपचार के जवाब में एक ट्यूमर के भीतर होते हैं कि प्रतिरूप संरचना में परिवर्तन को समझने के ट्यूमर कोशिकाओं के उन्मूलन के लिए और अधिक परिष्कृत और प्रभावी तरीकों में से डिजाइन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। हालांकि, ट्रैकिंग ट्यूमर प्रतिरूप उप आबादी की वजह से अलग पहचाना मार्कर की कमी के चुनौतीपूर्ण हो गया है। इस समस्या का समाधान करने के लिए, एक VDJ-सेक प्रोटोकॉल VDJ पुनर्संयोजन और दैहिक अतिउत्परिवर्तन (SHM), बी सेल लिंफोमा के दो अनूठी विशेषताओं का शोषण करके फैलाना बड़ी बी सेल लिंफोमा (DLBCL) डूबने का प्रतिरूप विकास पैटर्न का पता लगाने के लिए बनाया गया था।
इस प्रोटोकॉल में, अनुक्रमण क्षमता के साथ अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) पुस्तकालयों प्राथमिक निदान और पतन DLBCL samp के जोड़े से परिलक्षित पुन: व्यवस्थित इम्युनोग्लोबुलिन भारी श्रृंखला (IGH) VDJ क्षेत्र से निर्माण किया गयालेस। नमूना प्रति औसत अधिक लाख आधे से अधिक VDJ दृश्यों VDJ पुनर्व्यवस्था और SHM जानकारी दोनों होते हैं, जो अनुक्रमण, बाद प्राप्त किया गया है। इसके अलावा, अनुकूलित जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइनों पूरी तरह से इन नमूनों के भीतर IGH-VDJ प्रदर्शनों की सूची के लक्षण वर्णन के लिए अनुक्रम जानकारी का उपयोग करने के लिए विकसित किए गए। इसके अलावा, पाइपलाइन पुनर्निर्माण और निदान ट्यूमर और निदान और पतन ट्यूमर जोड़े के बीच क्लोनल विकास पैटर्न की कटौती के भीतर प्रतिरूप विविधता की परीक्षा में सक्षम बनाता है, जो व्यक्ति के ट्यूमर का प्रतिरूप वास्तुकला, की तुलना की अनुमति देता है। कई निदान-पतन जोड़े को यह विश्लेषण आवेदन, हम कई विशिष्ट ट्यूमर विकासवादी पैटर्न DLBCL पतन के लिए नेतृत्व कर सकता है कि महत्वपूर्ण सबूत खुला। साथ ही, इस दृष्टिकोण इस तरह के कम से कम अवशिष्ट रोग की पहचान, पतन की प्रगति और उपचार की प्रतिक्रिया की निगरानी, और प्रतिरक्षा repertoir की जांच के रूप में अन्य नैदानिक पहलुओं में विस्तार किया जा सकता है,गैर-लिंफोमा संदर्भों में ते।
Introduction
कैंसर एक प्रतिरूप बीमारी है। तीस साल पहले पीटर सी नोवेल कैंसर क्लोनल विकास मॉडल 1 प्रस्तावित कब से, कई अध्ययनों से ट्यूमर के नमूनों के भीतर प्रतिरूप आबादी काटना और tumorigenesis प्रक्रिया 2 आबाद है कि क्लोनल विस्तार और विकास पैटर्न को फिर से संगठित करने की कोशिश की है। हाल ही में, पूरे जीनोम अनुक्रमण प्रतिरूप विविधता और विकास 3,4 पर एक गहरी नज़र लेने के लिए जांचकर्ताओं के लिए सक्षम है। हालांकि, कई प्रकार की कोशिकाओं में विनयशील मार्कर की कमी के कारण, यह सटीक प्रतिरूप वास्तुकला और विकासवादी पथ अनुमान करना मुश्किल है। सौभाग्य से DLBCL सहित कई लसीकावत् कैंसर,, आरंभ जिसमें से परिपक्व बी कोशिकाओं में एक प्राकृतिक क्लोनालिटी मार्कर नहीं है। प्रतिजन उत्तेजना के जवाब में इन क्षेत्रों का एक बड़ा पूल से एक साथ खंड, प्रत्येक बी सेल एक वी एच (चर), एक डी (विविधता) में शामिल होने से एक भी उत्पादक IGH VDJ अनुक्रम फार्म कर सकते हैं, और एक जम्मू एच (शामिल होने)। इस जनसंपर्क के दौरानocess, मूल अनुक्रम के छोटे हिस्से को हटाया जा सकता है और अतिरिक्त गैर templated न्यूक्लियोटाइड एक अनूठा VDJ पुनर्व्यवस्था बनाने के लिए जोड़ा जा सकता है। इस विशिष्ट VDJ पुनर्व्यवस्था इसलिए व्यक्ति परिपक्व बी सेल और अपनी संतानों 5 टैगिंग, इस बी सेल के सभी संतान में विरासत में मिला जा सकता है। इसके अलावा, SHM एंटीबॉडी पूल के विस्तार और एंटीबॉडी आत्मीयता 6 को बढ़ाने के लिए अतिरिक्त म्यूटेशन को पेश करने के बाद के कीटाणु केंद्र (जीसी) प्रतिक्रिया में recombined VDJ दृश्यों पर होता है। इसलिए, की तुलना और इन प्रक्रियाओं से गुजरा है कि लिम्फोमा के नमूनों की VDJ और SHM पैटर्न विषम द्वारा, इंट्रा-ट्यूमर विविधता चित्रित किया जा सकता है और इस रोग के प्रतिरूप विकास पथ deduced किया जा सकता है।
इससे पहले, VDJ पुनर्व्यवस्था और SHM अनुक्रम जानकारी प्राप्त करने के लिए पीसीआर उत्पादों, और बाद में सेंगर अनुक्रमण क्लोनिंग, recombined क्षेत्रों amplifying पीसीआर से पहचाना जा सकता है। यह दृष्टिकोण मैंपूरे recombined VDJ प्रदर्शनों की सूची का केवल एक बहुत छोटे से हिस्से को पुन: प्राप्त करने के लिए, और किसी नमूने के भीतर प्रतिरूप आबादी के समग्र प्रतिनिधित्व के लक्षण वर्णन निरोधक, कम throughput और कम उपज है। एक संशोधित दृष्टिकोण VDJ पीसीआर उत्पादों से NGS अनुक्रमित अनुक्रमण पुस्तकालयों पैदा करने और नमूना प्रति ज्यादा एक लाख आधे से अधिक recombined VDJ दृश्यों प्राप्त करने के लिए पीई 2×150 बीपी अनुक्रमण के प्रदर्शन से बनाया गया था। इसके अलावा, एक कस्टम पाइपलाइन फिल्टर VDJ अनुक्रमण प्रत्येक पढ़ने के rearrangements और SHMS की पहचान है, और प्रत्येक नमूने की प्रतिरूप वास्तुकला पर वंशावली विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए पढ़ता है, गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) प्रदर्शन के लिए पंक्ति में विकसित किया गया था। इसके अलावा, एक नया दृष्टिकोण आगे विभिन्न रोग चरणों में एकत्र नमूनों के लिए क्लोनल विकास पैटर्न को चिह्नित करने के लिए स्थापित किया गया है।
हम DLBCL रोगी के नमूने लिए इस तकनीक को लागू किया है। DLBCL अप करने के लिए एक वें में लगातार पतन के साथ गैर Hodgkin लिंफोमा के एक आक्रामक रूप हैरोगियों 7 की IRD। कुछ 5 साल 8 के बाद होती है, हालांकि DLBCL relapses के सामान्य रूप से, प्रारंभिक निदान के 2 से 3 साल के भीतर, जल्दी होते हैं। Relapsed रोगियों के लिए रोग का निदान केवल 10% की वजह से सीमित उपचार के विकल्प के लिए 3 साल प्रगति मुक्त अस्तित्व प्राप्त करने के साथ, गरीब है। इस DLBCL पतन 9,10 के इलाज के लिए उपन्यास दृष्टिकोण के लिए तत्काल जरूरत के लिए आधार है। हालांकि, DLBCL पतन के साथ जुड़े आणविक तंत्र अभी भी काफी हद तक अनजान हैं। विशेष रूप से, DLBCL पतन के विकास के दौरान निदान और क्लोनल विकास पर प्रतिरूप विविधता की भूमिका, वर्तमान में uncharacterized हैं यह मुश्किल पतन की भविष्यवाणी करने के लिए एक सटीक और उपयोगी बायोमार्कर परिभाषित करने के लिए कर रही है। इन सवालों को संबोधित करने के लिए, हम से मिलान प्राथमिक निदान-पतन DLBCL नमूना जोड़े के कई जोड़े पर हमारे VDJ अनुक्रमण दृष्टिकोण लागू होता है। डूबने के दो अलग प्रतिरूप विकासवादी परिदृश्यों निदान और पतन samp के बीच प्रतिरूप आर्किटेक्चर की तुलना से उभराकई आणविक तंत्र चलता है कि लेस DLBCL पतन में शामिल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
क्योंकि मानव बी कोशिकाओं की IGH ठिकाना पर VDJ पुनर्व्यवस्था और SHM द्वारा कोडित अनुक्रम जानकारी के पुनरावृत्तियों के लगभग असीमित संख्या के कारण, उच्च throughput गहरे अनुक्रमण द्वारा पूरे IGH प्रदर्शनों की सूची की ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.
Materials
| Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
| TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
| Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 – Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
| IGH Gene Clonality Assay – Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6×1 L |
| 50X TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
| Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
References
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