結腸幹細胞変異の定量
Summary
We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.
Abstract
幹細胞の変異を測定する能力は、化学物質が潜在的に癌を引き起こす突然変異を誘発することができた場合、どの程度に重要な細胞集団に定量化するための強力なツールです。 X連鎖グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子で幹細胞変異を定量化するための酵素アッセイの使用は、以前に報告されている。1この方法は、得られる反応混合物と切片の組織の凍結切片とのインキュベーションの準備が必要青色細胞は、機能的なグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）酵素を生成した場合。そうでない場合、細胞が白っぽく見えます。我々は、ポリビニルアルコールの代わりに、最適切削温度化合物（OCT）培地を用いて反応混合物に変更しました。これは、pH測定を容易にG6PD染色成分の可溶化を増加させ、G6PD酵素の拡散を制限します。突然変異は、幹細胞で生じたことを実証するために、全体の陰窩はG6PD酵素を欠いている必要があります活動。幹細胞が抱いている場合のみ、表現型G6PD変異は陰窩における子孫のすべては、G6PD酵素活性を欠くであろう。幹細胞変異を有する陰窩を識別するために、4つの連続した隣接する凍結切片（レベル）が7μmの厚さで切断しました。隣接するカットを作るこのアプローチは、同じ変異した地下室は、隣接するセクションで観察されるので、地下室が完全に変異させたコンホメーションを提供します。 50μmより離れた組織サンプルとスライドは、マウスあたり> 10 4陰窩の合計を評価するために調製しました。突然変異頻度は、治療群では、野生型（青）陰窩の数で÷観測された変異した（白）陰窩の数です。
Introduction
大腸癌は、DNAに損傷を与えることができ、環境エージェントと食物成分への曝露を伴い、（ 例えば 、APC）の腫瘍抑制遺伝子に変異を癌遺伝子に体細胞変異を活性化（例えば、β-カテニン）または不活性化生成すると考えられています。これは、これらの重要な突然変異は結腸幹細胞において生じることが想定されます。なぜなら結腸上皮の固有の暗号アーキテクチャのために、それは、結腸発癌に関連する化学物質に動物を曝露した後に、結腸中の幹細胞の変異を測定することができます。突然変異がクリプト内の全ての細胞に存在することになるなど、いくつかのX連鎖酵素は、幹細胞で起こる突然変異のための指標としての役割を果たすことができます。
以前は、手順は、マウスにおいて結腸腫瘍を誘発する化学物質はまた、X連鎖グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）遺伝子の突然変異の分析によって結腸における体性幹細胞の突然変異を生成することを実証掲載されました。1-3この方法は、任意選択圧なしで結腸幹細胞におけるランダムな体細胞変異の発生率を定量化します。手順は、処理されたマウスおよび対照マウスからの未固定凍結された大腸セクションの生産と機能G6PD活性を産生する細胞を欠いている陰窩の同定を含みます。 、白く見えるこれらの変異した陰窩は、変異はまた、変異したG6PD遺伝子を有する子孫を生じさせた幹細胞で発生したことを示しています。酵素アッセイでは、G6PD欠損変異体の陰窩は、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）の還元のために必要とされるグルコース-6-リン酸を酸化することができません。 G6PD酵素が機能している場合には、染色用混合物中のNBT青色酵素及び「染色」は、細胞の位置に蓄積し、不溶性のホルマザン沈殿物に還元されます。 G6PDの変異体である細胞は青く染色された野生型陰窩とは対照的に白っぽいまま。この方法は、「ヌル」表現型を有する変異を測定します。 enため、zymes、例えば、G6PDとして、切片を水溶液中に置かれた場合に非固定組織切片上で細胞外に拡散することができ、それは分析されるべき組織切片中の酵素を安定化するために必要であり、図4中の酵素の安定化組織は、G6PD酵素反応に必要な試薬の小分子の拡散を妨害してはなりません。
私たちは、元のプロシージャに大幅な変更の数を行いました。重要な酵素染色培地は、pH制御およびアッセイにおいて使用される成分の可溶化を容易に最適切削温度化合物（OCT）にポリビニルアルコールから変更されています。それぞれの組織切片は、G6PD反応混合物の同じ量を受信するようにスチールワッシャからなる0.5 mlのウェル – 染色は、0.4を用いて行われます。手順がなくても、結腸組織の大規模なサンプリングを提供して撮像されたセクション内の陰窩の数を推定するために開発されましたmanually>各コロンのための10 5陰窩をカウントします。隣接7μmの組織切片の分析は、潜在的な染色アーチファクトを低減する複数のスライド上の変異陰窩の視覚化を提供します。これらの変更は、手順がより効率的かつ再現可能にします。
この修正されたプロトコルを使用して、我々は、げっ歯類においてよく知られている結腸の発癌物質のアゾキシメタンをC57BL / 6マウスの曝露後の結腸幹細胞の突然変異頻度を定量化している。5-7
Protocol
Representative Results
Discussion
多くの場合、化合物の遺伝毒性作用はDNAを改変する能力によって決定されます。これは通常、組織を単離し、DNA付加体の全体的なレベルを測定することによって行われます。 AOMの場合、これはOを結腸6 -メチルグアニン付加物を定量伴います。そのような幹細胞ニッチのような特定の細胞型内の損傷に対するこのアプローチの情報を使用して、失われます。付加体の小さなサブセット…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は何の確認応答がありません。
Materials
| reagents | |||
| nitroblue tetrazolium | |||
| NADP | |||
| glucose-6-phosphate | |||
| 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate | |||
| dimethyl formamide | |||
| phosphate buffer (pH 7.4 | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | |||
| Equipment | |||
| light microscope equipped with 5 megapixel camera | |||
| cryostat | |||
| warm room |
References
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