We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.
Neurale stamceller (NSC) i subventrikulære zone af laterale ventrikler (SVZ) fastholde olfaktoriske neurogenese hele livet i pattedyrs hjerne. De successivt generere transit forstærker celler (TAC'er) og neuroblaster der differentierer til neuroner, når de integrerer de olfaktoriske pærer. Emerging fluorescerende cellesortering (FACS) teknikker har tilladt isoleringen af NSC samt deres afkom og er begyndt at kaste lys over gen regulatoriske netværk i voksne neurogene nicher. Vi rapporterer her en cellesortering teknik, der gør det muligt at følge og skelne cellecyklussen dynamik ovennævnte cellepopulationer fra voksne SVZ'en med lex / EGFR / CD24 triple farvning. Isolerede celler udplades dernæst som adhærente celler at udforske i detaljer deres cellecyklusprogression ved time-lapse video mikroskopi. Til dette formål bruger vi transgene Fluorescens Ubiquitinering Cell Cycle Indikator (Fucci) mus, hvor cellerne er røde-fluorescerende during G 1 fase på grund af en G 1-specifikt røde Cdt1 reporter. Denne metode har for nylig afsløret, at prolifererende NSC'er gradvist forlænge deres G 1 fase under aldring, hvilket fører til neurogenese værdiforringelse. Denne metode er let overføres til andre systemer og kunne være af stor interesse for studiet af cellecyklussen dynamik hjerneceller i forbindelse med hjernen patologier.
Hvilende neurale stamceller (NSC) er kilden til voksne neurogenese 1 og kan omdannes til deres proliferative "aktiveret" form, der udtrykker EGFR (aNSCs) 2. Når den er aktiveret, de giver anledning til transit forstærke celler (TAC) 3 og derefter neuroblasts der migrerer til de olfaktoriske pærer (OB) gennem et rør af astrocytter og til sidst differentiere til neuroner 4,5. NSC og deres afkom er organiseret i specialiserede "nicher" arkitekturer langs de laterale ventrikler, implicerer et utal af faktorer, der styrer deres spredning 6. Isoleringen og oprensningen af SVZ neurogene celler er nødvendig for at forstå den komplekse molekylære regulering af deres proliferation, men er forblevet en udfordring for lang tid på grund af manglen på specifikke markører og tilpassede teknikker.
Nye metoder ved hjælp af flowcytometri har muliggjort isoleringen af NSC og their afkom fra den voksne SVZ 2,7-11. Brug af stamcelle markør LeX 12 sammen med neuroblast markør CD24 13 og en fluorescens EGF at mærke EGFR på prolifererende celler 2, vi for nylig udviklet en FACS strategi tillader rensning af fem af de vigtigste SVZ neurogene populationer: hvilende og aktiverede NSC, TAC, umodne såvel som migrerer neuroblaster 9. Her beskriver vi i detaljer denne celle sortering og hvordan en lex / EGFR / CD24 triple farvning tilladt for første gang isolering af både hvilende og aktiverede NSC'er.
Selvom neurogenese fortsætter i voksenalderen, er produktionen af nye neuroner drastisk faldet i den aldrende hjernen 14. De fleste undersøgelser er enige om en gradvis reduktion i antallet af prolifererende progenitorceller i SGZ og SVZ 15-20. Konsekvenserne er ikke uskadelige, da aldersrelaterede fald i neurogenese i SVZ'en fremkalder en formindskelse af newborn neuroner i de olfaktoriske pærer i den gamle hjerne, i sidste ende fører til forringelse i olfaktoriske diskrimination i alderen mus 18. Belyse cellecyklus kinetik neurale stamceller er et vigtigt skridt for at forstå mekanismerne bag udviklingen af voksne neurogenese under aldring. Nylige undersøgelser har undersøgt cellecyklus og slægt progression af voksne neurale stamceller in vitro 21 og in vivo 22, men ingen af dem benyttede sig af cellesortering teknikker og genetisk indkodede fluorescerende celle-cyklus-prober at visualisere cellecyklen faser af isolerede celler på en enkelt-celle niveau.
Her beskriver vi en protokol, der drager fordel af de transgene mus Fucci hvor celler fluorescerende under deres cellecyklus, således at sondringen mellem G 1 og SG 2 / M faser 23. Denne protokol viser, hvordan potentielle isolering af NSC og deres afkom fra voksne Fucci mice kombineret med time-lapse video mikroskopi tillader undersøgelse af cellecyklus dynamik på et enkelt-celleniveau.
Cellen sortering teknik beskrevet heri tillader pålidelig forskelsbehandling mellem hvilende NSC, aktiverede NSC og deres afkom muliggør studier af deres egenskaber og dynamik i den voksne hjerne 9. Kombineret med Fucci teknologi, som tillader visualisering af cellecyklusprogression i levende celler 23, udviklede vi en hurtig og effektiv teknik til at følge G 1 og SG 2 / M-faser af cellecyklus fra unge voksne og ældre mus hjerneceller.
Cellen sortering teknik, der anvendes i denne protokol var den første validerede kombination af markører tillader rensning af de fem vigtigste neurogene befolkninger fra SVZ'en 9. Det var også det første validerede teknik muliggør skelnen af hvilende og aktiverede NSC. Det er bemærkelsesværdigt, at denne teknik ikke kræver anvendelse af transgene mus per se, som er nødvendig, tilpasset transgene musemodeller sulm som Fucci. Siden da har Codega et al. 10 anvendes en GFAP-GFP / CD133 / EGFR triple mærkning kombination til at skelne hvilende NSC'er fra deres aktiverede modstykke, men det kan ikke tilpasses til Fucci teknologi, idet den kræver anvendelse af GFAP-GFP transgene mus. Mich et al. 11 har udviklet en GLAST / EGFR / CD24 triple mærkning strategi, der deler fælles resultater med den teknik, der anvendes i denne undersøgelse 9. Faktisk blev en høj korrelation mellem Lex og GLAST NSC'er markører allerede observeret i Daynac et al. Studere 9. Imidlertid er GLAST antistof, der anvendes i Mich et al. Teknik koblet til phycoerythrin og kan derfor ikke tilpasses med brugen af Fucci-Red mus.
Der er flere vigtige tekniske punkter, der kræver opmærksomhed før sorteringen SVZ celler. For det første dissociation trin er meget vigtigt, da hjernevævet skal dissocieres til enkeltceller samtidig bevare den strukturelle iintegrity af proteinerne anvendes til antistofmærkning strategi. 0,05% trypsin-EDTA har vist sig at være meget effektive til at dissociere SVZ væv 27, men lex antigen blev fundet at være meget følsomme næsten alle LeX-FITC immunfluorescens var tabt (data ikke vist). Således blev papain anvendt som det var mere effektiv og mindre destruktiv end andre proteaser på hjernevæv. Desuden blev hverken LeX eller EGFR eller CD24 ramt af papain behandling. Det skal bemærkes, at antistoffet mærkning blev ændret, hvis papain behandlingen oversteg 15 min. Vi opnåede optimale resultater med en 10 min papain behandling forbundet med en mekanisk dissociering (pipette op og ned 20 gange).
Poly-D-Lysin belægning tillader dyrkning af adhærerende celler og dannelsen af kolonier efter flere dage i kultur. Det er nu almindeligt accepteret, at in vitro-assays kommer med deres begrænsninger 28,29. Vi anbefaler, at bestemme kun den første celle cyklus forde celler, som undergår mindst en efterfølgende opdeling at holde sig så tæt som muligt på in vivo-fænotype.
Det er værd at nævne, at de Geminin (grøn fluorescens) og Cdt1 (rød fluorescens) proteiner anvendes til at designe Fucci systemet 23 tidligere viste sig at være rigeligt udtrykt ved neurale stamceller under tidlig neurogenese i mus 30 og voksne hjernevæv 9,25 . Selvom mKO2-hCdt1 (30/120) konstruktion hovedsageligt blev anvendt i den foreliggende undersøgelse at følge G1-fasen med rød fluorescens, brugen af begge konstruktioner [mKO2-hCdt1 (30/120) og MAG-hGem (1/110) ] kunne forudses at muliggøre visualisering af de vigtigste faser af cellecyklus (G 1 og SG 2 / M) samt G 1 / S overgangen 23. Den største ulempe ved tofarvet imaging er de begrænsede kompatible sæt af fluorescens, der stadig kan anvendes til mærkning af cellen. En løsning er at bruge separator;på søjler. For eksempel har vi med succes forarmet den CD24-positive fraktion fra celler ved hjælp adskillelse kolonner før celle sortering og leve-imaging, som vi brugte en CD24-PE antistof, der delte den samme emission bølgelængde end Fucci-Rød fluorescens 25.
Kun få studier har undersøgt længden af voksne mus SVZ populationer cellecyklus. Den samlede cellecykluslængden opnået med vores teknik er tæt på en estimeret in vitro af Costa et al. 21, men vi var i stand for første gang til at skelne mellem de forskellige cellecyklus faser. I et in vivo-undersøgelse, Ponti et al. 22 anvendes inkorporeringen af thymidin-analoger for at bestemme spredning dynamik forskellige SVZ cellepopulationer. Imidlertid kunne de hverken foretage en løbende overvågning af cellecyklus eller spore cellerne på enkelt-celle niveau. Dette kunne være et problem, da det blev vist, at en stærk heterogenitet findes within en given SVZ cellepopulation 22,25. Vi beskriver her et alternativ in vitro teknik, let at sætte op, der tillader levende billeder af cellecyklus faser af forskellig voksne neurogene befolkninger på et enkelt-celle niveau.
Fortsat en udfordring for udviklingen af nye terapeutiske tilgange i forbindelse med aldring eller hjernen patologier Forståelse reguleringen af cellens cyklus af neurale stamceller og stamceller. Vores protokol kan således have en bred vifte af anvendelser. I forbindelse med aldring, kan denne teknik også vise sig nyttigt at forstå virkningerne af aldringen på NSC differentiering. Faktisk er det muligt at identificere neurale stam- / progenitorceller ind differentiering som deres røde fluorescerende intensitet væsentligt højere 26. Endelig kunne det også være af interesse at udnytte den vedvarende levende billedbehandling på et enkelt-celle niveau til at studere cellens indre og ydre processer er ansvarlige for afstamning progression af voksne NSC.
The authors have nothing to disclose.
Vi står i gæld til C Joubert, V Neuville, V Barroca, J Tilliet og alle ansatte i dyrefaciliteter; til J Baijer og N Dechamps for cellesortering; O. Etienne til teknisk bistand, og A. Gouret for hendes administrativ bistand. Flowcytometri og cellesortering blev udført på iRCM flowcytometri delte ressource, oprettet ved tilskud udstyr fra DIM-Stem-polet, INSERM, Fondation ARC, og CEA. Dette arbejde blev støttet af tilskud på Electricité de France (EDF). MD har et stipendium fra La Ligue Contre le Kræft og LM fra region Ile-de-France (DIM bioterapier). Marc-André Mouthon og François D. Boussin aktie co-senior forfatterskab.
96-well uncoated glass bottom culture plates | MatTek Corp. | P96G-1.5-5-F | |
µ-Plates 96-well | Ibidi | 89626 | |
Poly-D-Lysine | Millipore | A003E | |
NeuroCult NSC Basal Medium | STEMCELL Technologies | 5700 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplement | STEMCELL Technologies | 5701 | |
Heparin | STEMCELL Technologies | 7980 | |
EGF | Millipore | GF144 | |
FGF-2 | Millipore | GF003 | |
Papain | Worthington | LS003119 | |
EBSS | Invitrogen | 24010-043 | |
L-cysteine | Sigma | C-7352 | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Promega | V4231 | |
DNase I | Sigma | D5025-15KU | |
Trypsin inhibitor type II | Sigma | T9128 | Ovomucoid |
DMEM:F12 medium | Life Technologies | 31330-038 | |
20 µm filter | BD Medimachine Filcon | 340622 | |
Eppendorf microtubes 3810X | Sigma | Z606340-1000EA | |
BSA | Sigma | A1595 | Bovine serum albumin solution |
CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] | Life Technologies | A14776 | Mouse IgM; clone MMA. 1:50 |
CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] – conjugated | BD Biosciences | 332778 | Rat IgG2b; clone M1/69. 1:50 |
Mouse anti-human LeX antibody | BD Pharmingen | 559045 | Mouse IgM; clone MAM. 1:50 |
Alexa647 – conjugated EGF ligand | Life Technologies | E35351 | 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text |
CompBeads | BD Biosciences | 644204 | |
MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | separation columns (in the manuscript) |
Anti-mouse IgM microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
Hoechst 33258 | Sigma | 861405 | HO (in the manuscript) |
INFLUX cell sorter | BD Biosciences | FACS sorter (in the text) | |
Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti | Nikon Corp. | confocal laser scanning microscope (in the manuscript) | |
NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software | Nikon Corp. | NIS-Elements software (in the manuscript) | |
Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) | Nikon Corp. | ||
ECLIPSE Ti thermostated chamber | Nikon Corp. | thermostated chamber (in the manuscript) | |
ImageJ | RBS | ||
FlowJo | Tree Star, Ashland, OR | ||
FUCCI mice | RIKEN BioResource Center, JAPAN | Sakaue-Sawano et al. 2008 |