We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.
많은 미생물 생산 및 의료 분야, 식품 응용 프로그램 또는 석유 기반 화학 물질의 교체에 중요한 영향을 미칠 엑소 폴리 사카 라이드 (EPS)을 분비 할 수있다. 우리는 유형 및 미생물에 의해 생성 된 EPS 량의 빠르고 신뢰성 분석을 가능하게하는 액체 핸들링 시스템을 자동화 할 수있는 분석 플랫폼을 기술한다. 이것은 사용자가 새로운 천연 미생물 엑소 폴리 사카 라이드의 생산을 확인하는 고 처리율 (HT)에 하루 내에 해당 중합체의 탄수화물 지문 분석을 가능하게한다. 이 플랫폼을 사용, 엔지니어링 접근 방법에서 얻을 수 있습니다 변형 컬렉션뿐만 아니라 변형 변종의 라이브러리를 스크리닝 할 수있다. 이 플랫폼은 두 개의 주요 부분으로 프로토콜의 분리를 할 수있는 모듈 설정을 가지고 있습니다. 첫째, 다른 다당류 검출 모듈을 결합한 자동 선별 시스템이있다 : viscosit의 반 정량 분석원심 분리 공정과, 알코올 침전 법을 통해 형성 중합체의 분석 및 페놀 황산 변환을 통해 총 탄수화물 함량의 측정을 통해 Y 형성. 여기서, 실행 당 384 균주까지 선별 할 수있다. 두 번째 부분은 두 개의 핵심 모듈을 조합하여 처음 부분에서 식별 된 모든 선택된 EPS 생산자 상세한 단당류 분석을 제공한다 : 자외선 및 전기 분무 이온화 이온 트랩 검출 (결합 초 고성능 액체 크로마토 그래피를 통해 전체 단량체 조성물의 분석 UHPLC-UV-ESI-MS) 및 색상 형성에 결합되는 효소 적 산화를 통해 중합체 치환기 (피루브산 케탈 존재)로서 피루브산의 결정. 이 스크리닝 플랫폼의 전체 분석 모듈은 다른 방법으로 결합 된 개별 요건에 조정될 수있다. 또한, 그들 모두는 수동으로 처리되거나 액체 핸들링 시스템으로 수행 될 수있다. 이에 따라, 심사 괞 찮아다양한 EPS에서 폼을 식별하기 위해 큰 유연성을 가능하게한다.
미생물 엑소 폴리 사카 라이드 (EPS)은 다양한 생물학적 기능을 수행 고분자의 구조적으로 매우 다양한 그룹입니다. 그들은 일반적으로 다른 단량체의 종류 (설탕, 설탕 유도체, 설탕 산), 이들 단량체 및 대체 사이의 결합에 의해 구별된다 복잡한 반복 단위의 내장되어 있습니다. 미생물 다당류의 구조적 다양성은 음식 1 등 다양한 분야에서 자신의 응용 프로그램을 수 있도록이 분자 클래스, 화장품, 3, 건설 화학 4 물 처리 (5)의 회원들에게 오히려 다른 특성을 부여한다. 상기 신규 한 자연 미생물 다당류의 식별뿐만 아니라 구조적 변형 엔지니어링 유망한 접근법을 대표 이러한 바이오 기초 및 지속 고분자의 응용 분야를 확장한다. 어느 쪽의 방법은, 빠른 스크리닝 방법을 신속하게 파묻혀에 대한 미생물 균주의 광대 한 수를 스캔하는 데 필요R 다당류 형성하고, 자신의 제품을 분석. 따라서, 최근 단량체 조성물 (6)의 식별을 포함하는 천연의 분리 물 또는 조작 된 변이체 균주의 미생물 다당류 생산의 분석을 위해 96- 웰 HT-스크리닝 플랫폼을 개발했다.
~ 500 천연 균주의 제 선별 라운드이 플랫폼에 적용하는 것은 우리가 EPS를 생성 할 수있는 바와 같이 약 10 %의 절연 균주 20를 식별 할 수 (데이터는 보이지 않음). 이 분석 균주 80-90 %의인가 조건하에 EPS 생성되지 않았고, 따라서, 상세한 탄수화물 지문의 추가적인 분석이 필요없는 것을 의미한다. 단량체 조성물이 고도의 식별로서 특히 데이터 분석을 위해 빠르고 사전 스크리닝 방법은, EPS 생산 양성 균주를 식별하는 효율을 대폭 증가하는 시간 소모적 인 과정이다. 또한, 시약,UHPLC-UV-ESI-MS에서 소모품 및 측정 시간을 단축 할 것이다. 한편 상기 방법은 매우 신뢰성있는 반면 또한, 상이한 분석 모듈, 병렬로 두 개 이상의 96- 웰 플레이트의 수동 조작이 복잡 한편이며, 같은 방법의 모든 가능성을 제한한다. 이러한 이유로, 우리는 자동 검사 플랫폼을 개발하기로 결정했다. 따라서 흡광도 측정에 기초하여, 전체 당 함량의 전자동 고속 검출 방법 기존 탄수화물 지문 기술의 모듈 형식 조합.
페놀 황산 방법은 아직 세균과 식물 다당류 7,8의 전체 탄수화물 함량의 빠른 측정을위한 선택의 방법을 나타낸다. 이 방법은 먼저 96 웰 플레이트 10, 11에서도 작은 규모에 대해, 다른 응용 프로그램 및 샘플 크기에 뒤부아 등. (9)에 의해 기술 및 적응했다. 프NOL – 황산 방법은 모든 모노머, 올리고머 및 폴리머 샘플의 탄수화물을 합하여, 하나의 값에 의해 전체 탄수화물 함량을 측정한다.
고려 이러한 측면을 고려하여 적합한 배양 배지의 선택은이 방법을 적용하는 것이 필수적이다. 올리고머 또는 효모 추출물 등의 탄수화물 고분자 화합물을 함유하는 복합 미디어 변경된 중합체 함량을 초래할 수도 있으므로, 엄밀 피해야한다. 또한, 설탕의 높은 금액은 균주의 배양을위한 C 소스로 사용됩니다. 배양 과정에서 남은 탄수화물 높은 수준의 부정적인 EPS 함량의 측정을 방해 할 수있다.
따라서, 정의 된 순수한 당류의 사용이 권장된다. 실험에서는 세포의 배양을 위해 포도당을 사용 하였다. 배양 후 남은 글루코스는 겔 여과를 통해 감소 및 혈당 분석을 통해 측정 하였다. 마지막으로, 포도당 당량다당류들 페놀 황산 방법에 의해 검출되었다 전체 탄수화물 함량에서 겔 여과 후 남은 글루코스를 뺌으로써 계산 하였다. 페놀 – 황산 방법과 함께 젤 여과 및 포도당 분석은 신뢰할 수있는 결과를 보장하고 우리의 첫 번째, 완전히 자동화 탐지 시스템 인 할 수있다.
침전 점도 증가의 관찰 : 두 개의 새로운 분석 모듈은 EPS 검출 시스템에서의 정보의 양을 증가시키기 위해 자동화 된 스크리닝 플랫폼으로 하였다.
다양한 EPS – succinoglycan 예, 크 산탄 및 결장 산 12 – 당 위치 C4 및 C6에 비 탄수화물 피루브산 케탈로 변형되는 것으로보고되어있다. (단 숙시 반 에스테르 또는 우 론산 등) 그 피루브산 케탈 물리적 prope에 따라서 음이온 성질에 기여2가 양이온의 다리 (13)를 통해 상호 작용함으로써 중합체 rties. 그 특정 중합체를 식별하기 위해서 피루 베이트의 결정은 또 다른 추가 분석 모듈로 설립되었다. 이 다당류 치환기 잠재적 거시적 성질에 대한 정보를 증가시킨다.
모든 모듈을 결합하면 다른 EPS의 식별뿐만 아니라 EPS 생산의 신속하고 효율적인 결정을 할 수 있습니다. 그 방법으로 심사 플랫폼은 두 개의 주요 부품 (그림 1)으로 구분 될 수있다. 자동 검사 (파트 I) 워크 플로가 완전 자동화 발생 이내 (표 1) 신속 균주를 생산하는 EPS를 미리 선택합니다. 탄수화물 지문 분석 (파트 II)를 정량적으로 미리 선택된 균주에 의해 생성 된 EPS의 단량체 조성물을 결정한다. 이에 따라, 데이터 분석은 큰 변형 모음 스크리닝을 최적화하기 위해 최소화되었다. 이하나의 자동화 된 검사 실행에 하루 768 균주의 하루 가능 2 실점으로 384 균주를 분석 할 수있는 가능성을 제공합니다. 또한, 탄수화물 지문 분석은 모든 확인 된 EPS의 더욱 상세한 개요를 제공합니다. 이 감독 분석 및 EPS의 이미 설명한 화학 구조에 비해 약간 다른 EPS 변형 또는 완전히 새로운 식별 할 수 있습니다.
페놀 – 황산 방법 다당류 감지 : 다른 단당류는이 방법 (9)를 이용하여 서로 다른 최대 흡수와 몰 흡광 계수를 보여줍니다. 이것은 상이한 양의 여러 당류를 함유 중합체, 다양한 최대 흡수를 초래한다. 16 다른 시판 중합체의 최대 흡수의 상이한 파장을 표 5에 나타내었다. 중합체 (1 ㎍ / L)에 용해시켰다 DDH 2 O로 (150 RPM) 밤새 교반 페놀 황산 – 방법으로 측정 . Diutan 검 470 nm 내지 scleroglucan 히알루 론산 484 nm에서 최고 최저 최대 흡수를 보였다. 이러한 결과를 바탕으로 480 nm의이 선별 플랫폼에 대한 선택되었다. 중합체의 상대적인 흡광도 (100 %로 설정) 1g / L의 글루코스 얻어진 흡광도에 기초하여 산출 하였다. 최저 결과는 92 %로 모두 scleroglucan 및 succinoglycan 수득 하였다. 이 특급했다scleroglucan는 포도당을 포함하고 succinoglycan 7의 비율로 포도당과 갈락토오스가 포함되어 있기 때문에 반사된다 : 1. 상업용 폴리머 건조 및 다른 회분 함량 다른 손실을 가지고, 이것은 ~ 110 %의 이론적 인 값에 도달하지 않은 이유이다. 자일란 311 %의 높은 상대 흡광도를 나타냈다. 이러한 이유 때문에 보이면서 퓨 라노스 형태 자일 로스로 달성 높은 몰 흡광 계수이다. 0.1 g / L의 글루코스의 수준 정량 한계에 도달하고,뿐만 아니라 농도 <0.05 g / L의 검출 한계. 그러나, 스크리닝에서 양성 균주에 대한 검출 한계 이상 0.7 g / L이고, 따라서, 상기 분석은 우수한 성능을 보였다. 신뢰성있는 결과를 얻기 위해, 겔 여과 후 남은 글루코스는 글루코스 세이로 측정하고,이 값은 페놀 – 황산 방법의 값으로부터 감산한다.
자동화 된 포도당 분석 희석 : 성능재배 (희석 1 : 100) 후에 글루코스 판정 조사 하였다. 이를 위해, 10 μL의 상등액을 흡인하고,이 희석액 180 ㎕를 디스 펜싱을 통하여 열 배 깊은 웰 플레이트 DDH 2 O 990 μL에 옮기고, 혼합 하였다. 두번째 중요한 단계는 겔 여과 후 글루코오스 분석에서 1시 10분 희석 5 μL 분취 정확한 피펫 팅 하였다. DDH 2 O의 희석액 25 μl를 생성하기 위해 제 50 μL 팁으로 옮기고, DDH 2 O 5 ㎕를 겔 여과 후 20 μL 함께 흡입 하였다. 이것은 선단에서 5 μL 분취 더 나은 제거를 보장한다. 두 희석 단계가 포도당 분석을 통해 다양한 포도당 표준을 확인 하였다. 두 실시 농도에 대한 결과를 표 6에 제시되어있다 : 1. 100 희석 포도당 함량의 측정을위한 배양은 CV & # 함께 모두 표준 고정밀 나타났다 후에60 1.2 %. 동시에, 높은 표준 정확도는 11.6 (% 에러)까지이다. 글루코오스 판정 배양 후에 만 남은 글루코스 콘텐츠를 나타내고, 따라서 중합체 검출 중요하지 않다하지만, 이는 무시할 수있다. 겔 여과 후 남은 포도당의 1시 10분 희석은 CV <1.4 %와 정확도 <2.1 %의 오류와 함께 매우 신뢰할 수있는 결과를 보여 주었다.
증발의 고려 사항 : 심사는 최초의 포도당 분석하는 첫 번째 단계에서 3.5 시간이 필요합니다. 이 기간은 캡핑 MTP 저장소에 영향을 미치는 것인지, 알아 내기 위해, 글루코오스 분석 교정 표준의 50 μL 함께 로봇 컨베이어에서 3.5 시간 동안 커버없이 저장 하였다. 교정 범위 (45-4.5 ㎎ / ℓ)에서 시료 농도는 거의 증가하지 않는다. 증가 – 증발에 의해 발생은 – 2.1 % 이하 만이 가장 낮은 농도 (1.8 및 0.9 ㎎ / ℓ)은 12.4 %까지 도달 (위해이었다 <str옹> 표 7).
겔 여과 : 비 글루코스 대사의 많은 양이 가수 분해 중합체 글루코오스 정량 검출을 방해. 따라서, 겔 여과 단계 배양 후 남은 글루코스를 제거해야한다. 또한, 겔 여과 단량체 분석 분석 백그라운드를 최소화하기 위해, 글루코스보다 염 및 탄수화물 단량체 화합물 등으로부터 상층 액을 함유하는 중합체를 정화한다. 겔 여과 단계에서 여과 액 35 μL를 웰의 중앙에 배치했다. 자동화 된 시스템의 겔 여과의 안정성 검증을 위해, 9g / L 포도당 최대 0.045에서 팔 교정 표준을 여과 하였다 (N = 8). 모든 농도의 글루코스는 항상 초기 값 (표 8)의 95 % 이상 감소 하였다. 이 과정에서 겔 여과 포도당의 다양한 농도에 매우 좋은 결과를 보여 주었다. 또한, 잔류 글루코스 겔 F 후iltration 또한 글루코오스 분석으로 결정되고 가수 분해 중합체 포도당 당량의 정확한 양을 수신 페놀 황산 판정로부터 감산 하였다.
피루 베이트 세이 : 첫째는, 상기 가수 분해 단계에서 중화 희석 (1시 10분) TFA 매트릭스는 효소 반응을 방해하는지 여부를 조사 하였다. 따라서, 전체 분석은 한 시간과 한 번 매트릭스없이, 두 번 수행하고 신뢰할 수있는 결과를 보여 주었다. 마지막으로, 16 개의 시판되는 중합체의 피루브산 콘텐츠 성공적 측정하고,도 3에 도시되어있다. 일반적으로 이들 중합체에서 16 만 succinoglycan 잔탄 자연스럽게 피루브산을 함유하는 것이 알려져있다. 우리 피루브산 시험 법으로 이들 중합체는 모두 정확하게 식별되었다. scleroglucan에서, 웰란 검 및 크 실란 피루 베이트는 상당한 양의 검출되었다. 전반적으로, 접근 방식의 기능을 검증하고, 피루 베이트 – 분석의 한높은 성능을 howed. 이 가수 분해 후, 다른 중합체의 피루브산을 검출 할 것을 알았다.
탄수화물 지문 : 자동화 된 검사의 모든 분석 모듈을 수행 한 후, 잠재적 EPS 생산은 탄수화물 지문 분석을 위해 선정되었다. 이를 위해 여러 가지 기준을 적용 하였다 : 점도 1) 포지티브 관찰 원심 분리 및 / 또는 여과 후. 2) 강수 전 여과 후. 관측 된 섬유 조각은 긍정적으로 평가 하였다. 페놀 – 황산 방법 3) 포도당 해당하는 값입니다. > 700 ㎎ / ℓ 값은 긍정적으로 평가하고, 300 및 700 ㎎ / ℓ 사이의 값을 추정 EPS 생산 업체로 평가되었다. 두 개 또는 세 개의 기준이 포지티브로 계산 된 경우, 상기 균주 탄수화물 지문 분석을 위해 선별 하였다. 기준은 EPS 검사 (예를 들어 저점 EPS)의 개별 목적으로 사용자 정의 할 수 있습니다. 우리의 접근 방식은 effici 발견을 목표로엔트는 생산자 EPS. 단지 EPS 소량 생산 균주를 검색 할 때 포도당 당량의 평가 제한이 감소한다.
기술 이익과 미래의 응용 프로그램이 프로토콜의 한 가지 흥미로운 기능은 단계와 다른 분석 모듈의 모듈 식 문자입니다. 이들은 개별 요구 조정, 다양한 방식으로 조합 될 수 있고, 신규 모듈은 쉽게 구현 될 수있다. 또한, 상기 분석 모듈은 개별적으로 사용될 수있다 예를 들어 HT-PMP-유도체 모듈과 함께 가수 분해 모듈은 96 웰 포맷에서 다른 중합체 용액 (1g / L)에서 단량체 조성 분석을 수행 할 수있다. 전체 검사가 피펫 방식의 변경없이 직접 처리 할 수있는 액체 처리 시스템에 접속하지 않고도 실험실. 그러나, 액체 핸들링 시스템을 이용하여 최대 768 균주 (대신 screene 경우 192 균주 처리량을 증가하루에) 수동 d를. 여기에서 설명하는 프로토콜은 서로 다른 장군에 대한 선별 할 수 있고, 따라서, 신규 EPS 생산자를 확인하고 하나의 접근 방법 (그림 4)에서 자신의 탄수화물 지문을 분석하는 큰 변형 컬렉션의 심사합니다. 또한, 푸 코스 등 희소 당, 우 론산 또는 미지의 당을 함유 폴리 사카 라이드에 대한 표적 스크리닝 상세한 단당류 분석을 통해 수행 될 수있다. 또한, 정의 된 비율이 다른 당 조합을 검출 할 수있다. 이것은 이미 알려진 EPS 또는 새로운 EPS의 구조적으로 관련된 변종의 단순한 식별 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
We sincerely thank Thomas Howe and Jörg Carsten for the programming and technical support with the liquid handling systems.
96 well deep well plate 2.0 mL (DWP) | Greiner Bio-One | 780271 | Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990µl of ddH2O |
Breathable Sealing Film | Axygen | BF-400-S | Incubation film for pre- and main-culture DWP |
Aluminum Sealing Film | Axygen | PCR-AS-200 | -80 °C storage film for glycerol-stock plates |
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl | TECAN | 30038619 | Worktable position (WTP 2-1 to 2-4) |
A/B glass-filter-plate 1µm | Pall Corporation | PN 8031 | Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4) |
96-well micro titer plate V-Bottom | Greiner Bio-One | 651201 | Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4) |
96-well SpinColumn G-25 | Harvard Apparatus | 74-5612 | Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7) |
96-well micro titer plate V-Bottom | Nunc | 249944 | Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4) |
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips | TECAN | 30038609 | Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6) |
Trough 250 ml | Axygen | Res-SW96-HP | Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetat buffer pH 5.6 (CP 5-7) |
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP) | Greiner Bio-One | 655101 | precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2) |
96-well silicon cap mat | Whatmann | 7704-0105 | Cover mat for MTP |
200 µl pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | For manually handling |
1000 µl pipette tips | Sarstedt | 70.762 | For manually handling |
96-well-PCR micro titer plate | Brand | 781350 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat | Brand | 781405 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
Filter plate 0.2 µm Supor, | Pall Corporation | PN 8019 | Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate |
Pipette Tips LHS 5-300 µl | Brand | 732150 | Brand LHS system |
ABTS (2.2-azino‑bis-(3‑ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid) | Sigma-Aldrich | A1888 | Glucose-assay |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | Glucose-assay |
Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Glucose-assay, pyruvat-assay |
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt) | Wako Chemicals GmbH | 043-22351 | Pyruvat-assay |
Pyruvate oxidase | Sigma-Aldrich | P4591 | Pyruvat-assay |
Potassium phosphate dibasic | Carl-Roth | P749.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
Potassium phosphate monobasic | Carl-Roth | 3904.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Pyruvat-assay |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 31413 | Pyruvat-assay |
2-Propanol | VWR | 20922.466 | Precipitation |
Phenol | VWR | 20599.231 | Phenol-sulfuric-acid method |
Sulfuric acid | Carl-Roth | 4623.4 | Phenol-sulfuric-acid method |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | Hydrolysis |
Ammonium solution | Carl-Roth | P093.1 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
Phenol red | Alfa Aesar | B21710 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone | Sigma-Aldrich | M70800 | PMP-derivatization |
Methanol LC-MS | VWR | 83638.320 | PMP-derivatization |
Acetonitril LC-MS | VWR | 83040.320 | PMP-derivatization |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 338826 | PMP-derivatization, |
Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | PMP-derivatization |
Methyl red | Alfa Aesar | 36667 | pH-value |
Robotic liquid handling system | Tecan | Freedom EVO | Worktable setup in Figure 2 |
Liquid handling station LHS | Brand | 709400 | Worktable setup in Figure 2 |
Tip-Adapter | Brand | 709434 | Worktable setup in Figure 2 |
Liquid Ends MC 20-300µL | Brand | 709416 | Worktable setup in Figure 2 |
Adapter 60mm | Brand | 709430 | Worktable setup in Figure 2 |