ex vivoで腸嚢は、胃腸疾患のモデルに粘膜透過性を評価するために
Summary
This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or “intestinal sacs” as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.
Abstract
上皮バリアは、胃腸管の最初の先天的防御であり、選択的基盤となる組織区画に内腔からの輸送を調節し、上皮を通過する小さな分子の輸送を制限し、ほぼ完全に上皮高分子輸送を禁止します。この選択性は、親油性分子との両方の頂端受容体および上皮のタイトジャンクションタンパク質複合体の輸送を制限する粘液ゲル層によって決定される。上皮のin vitro細胞培養モデルは便利であるが、モデルとして、それらが欠け微生物、粘液ゲル、上皮および免疫系の間の相互作用の複雑さ。一方、腸管吸収または浸透性のインビボ評価を行うことができるが、これらのアッセイは、部位特異性の兆候と、全体的な消化管吸収を測定する。「腸の嚢」を用いてエクスビボ透過性アッセイ;腸の部位特異性の付加的な利点と、特定の分子の全体的な腸の整合性や比較のトランスポートのいずれかを測定するの迅速かつ高感度な方法です。ここでは、透過性の研究と見かけの透過性（P アプリ ）の計算のための腸嚢の調製を記載 腸管バリアを通過する分子の。この技術は、薬物吸収を評価する方法として使用することができる、または胃腸疾患の動物モデルにおける地域上皮バリア機能障害を検討します。
Introduction
消化管の腸上皮障壁はヒト成人で400メートル2で推定粘膜表面積です。したがって、常に微生物、摂取薬、栄養素や細菌毒素から挑戦にさらされています。ホストが許容共生細菌と潜在的な病原体を区別しなければならないだけでなく、同時に、栄養素の吸収を可能にしながら、上皮関門を通過するから、これらの種とそれらの分泌分子を防止しなければなりません。このように、腸上皮の役割は、管腔の内容物1に対する選択的障壁として作用することです。これは部分的に、構成的および誘導機構2からなる反応性生物系を介して作用する粘膜における先天上皮防御システムによって、達成されます。
上皮バリア機能の喪失は、胃腸疾患の多数の特徴的な病理である。 インビボでの上皮のバリア機能の検査は、トレーサー分子およびその後の血清の分析3の強制経口投与を介して評価することができます。しかし、この技術は、バリア機能障害のサイトへなどの兆候を提供していません。 vitroおよびトランスウェルシステム3を使用し、それぞれのチャンバ4,5をアッシング経上皮抵抗のex vivoでの評価では、一般的に上皮のバリア機能の代理マーカーとして使用するが、動物モデル6の貢献疾患の生理機能を欠いています。このプロトコルでは、レベルの数で粘膜バリア機能を評価するために使用され得る腸の完全性との直接及び局所的な評価を可能にするエクスビボ組織標本のモデルが記載されています。重要なことに、この手法は、疾患の動物モデルに適用することができる、または薬理学的に粘膜障壁機能障害の深さ質問に可能にするように操作することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、粘膜バリア機能のex vivoで評価するために分離および腸嚢の調製を詳述しています。腸の嚢の調製物は、主に腸を横断候補薬物の吸収を調べ、薬学研究に利用されています。しかし、このアッセイは、腸疾患の研究のためにも同様に適しています。領域と透過性の部位特異的な評価によって大きく異なる場合があります腸の透過性は、消化器疾患における粘膜の整合性の地域…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 and a Hunter Medical Research Institute grant sponsored by Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.
Materials
| Dekantel Non-absorbable Silk suture | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | Use at 10mM in media | |
| Small animal vascular cathether: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextran 4400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20,000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70,000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
References
- Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation. Frontiers in immunology. 4, 272 (2013).
- Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine. Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).
- Robinson, A., et al. Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition. Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).
- Feighery, L., et al. Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury. The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).
- Keely, S., et al. Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an ‘enteric tear’ mechanism. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).
- Keely, S., et al. Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis. Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).
- Sourisseau, T., et al. Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA. Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).
- Marks, E., et al. Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis. Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).
- Keely, S., et al. Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia. Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).
- Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers. Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).
- Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers. Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).
- Keely, S., et al. In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers. Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).
- Maher, S., et al. Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).
- Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells. Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).
- Stefka, A. T., et al. Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).
- Keely, S., et al. Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome. Gut microbes. 3, 250-260 (2012).
- Barrett, K. E., Keely, S. J. Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects. Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).
- Soni, J., et al. Rat, ovine and bovine Peyer’s patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).
- Justino, P. F., et al. Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice. Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).
- Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice. Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).
- Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota. Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).
